虎杖苷单体对急性病毒性心肌炎的影响

【摘要】  目的 探讨虎杖苷（PD）对柯萨奇病毒B3(CVB3)感染小鼠心肌微血管密度(MVD)的影响及对心肌的保护作用。方法 120只Balb／c雄性小鼠随机分为4组：正常对照组、CVB3感染组、CVB3感染加PD治疗组和PD对照组，分别在实验的第3、7、10、14、21、30天处死动物，留取血清和心肌标本，PFU法测定心肌组织内感染性病毒颗粒，免疫组化检测心肌CD34表达，显微镜下计数心肌组织MVD。结果 与正常对照组比较，感染组小鼠MVD计数增加(P＜0.05)；与感染组比较，PD治疗组小鼠心肌组织内病毒滴度明显低于感染组（P＜0.05）； MVD计数显著增高，死亡率显著降低(P＜0.05)。结论 PD可以明显减轻病毒性心肌炎时心肌病理损害,其保护作用可能与抗CVB3病毒和使心肌MVD增高有关。

【关键词】  虎杖苷 柯萨奇B3病毒 病毒性心肌炎 MVD

   Effect of polydatin monomer on acute viral myocarditis

    SONG Junhua1  WANG  Shuyun2  MU Daoyu2  et al

    1 Qingdao Health School，Qingdao 266071；2 School of Medicine ,Shandong University

    【Abstract】  Objective  To investigate the regulation effect of PD on the MVD of myocardia1 tissue and the effect of PD on viral myocarditis in vivo．Methods  One hundred and twenty male Balb/c mice were randomly divided into four groups：normal control group，the Coxsackie virus B3(CVB3) infected group，the CVB3 infected and PD treated group，PD control group．They were killed on days 3，7，10，14，21and 30 respectively．Serum and cardiac muscle were preserved.Virus titer in heart by plaqeforming assay.The CD34 immunohistochemical studies and medical imagine analysis were performed．Results  Markedly increased microvessel density were observed in the myocardial tissue of infected mice in comparison with contro1 group (P＜0.05)．Virus titer in group of CVB3 infected mice was significantly higher than that in group of infected mice with PD treatment.Markedly increased microvessel density were observed in PDtreated group in comparison with CVB3 infected group (P＜0.05),mortality was greatly reduced.Conclusion  PD therapy improved the severity of myocardial lesions in viral myocarditis.The therapeutic effect of PD might be mediated through resisting CVB3 and markedly increased microvessel density．

    【Key words】  polydatin，CVB3，viral myocarditis，microvessel density

    病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是临床常见的心脏疾患，发病率有逐年增高的趋势，但西医缺乏对本病的有效治疗药物。近几年来中药虎杖苷（PD）在防治冠心病方面取得了明显的效果。也有PD提取液具有抗CVB3病毒的作用的报道［1］，但无PD单体治疗VMC的相关报道。本实验旨在分析心肌病理改变与MVD之间的关系，探讨PD单体对VMC的影响。

    1  材料与方法

    1.1  材料  CVB3病毒Nancy株购自山东省医学科学院，经Hela细胞培养扩增后，冻融3次，上清液分装，测得半数组织感染率（TCID50）为106/ml，小量分装后-80℃保存备用； Balb/c小鼠购自解放军第一军医大学实验动物中心，SPF级，雄性，2～4周龄，体重12～18 g，共120只；虎杖苷由第一军医大学病理生理教研室提供；Rabbit anti CD34购自美国Neuwork公司；免疫组化SP试剂盒购自北京中山试剂公司； PBS缓冲液由山东大学医学院病理生理教研室提供；多聚赖氨酸购自福州迈新生物技术开发公司；DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司；Mouse VEGF ELISA Kit，FMK 0014购自Jingmei Biotech Co., Ltd公司。

    1.2  心肌炎模型的制备和分组  将小鼠随机分为4组：感染组30只和PD治疗组30只，每只腹腔接种0.1    ml TCID50为106/ml的CVB3病毒液；正常对照组30只和PD对照组30只，每只腹腔接种0.1 ml不含CVB3的Eagle's液。病毒接种日为0 d。PD治疗组从接种病毒稀释液3 d后、PD对照组从接种Eagle's液3 d后，每日尾静脉注射0.2 mmol/L的PD 0.1 ml，连续7 d；正常对照组和感染组均每日尾静脉注射0.1 ml生理盐水，连续7 d。

    1.3  标本留取 分别在接种后的第3、7、10、14、21、30天，每组随机抽取5只小鼠经眼球采血后断颈处死并留取心脏。将血离心后分装血清于-80℃冻存，无菌条件下取心脏，称重。一半用于病毒滴度测定，一半置4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，4  μm连续切片，备做HE染色和免疫组化。

    1.4  检测项目

    1.4.1  光镜下观察：10％甲醛固定，石蜡包埋，组织切片，HE染色后作组织病理学检查。心脏坏死的范围和细胞浸润范围用对照双盲法评分。心肌病理评分标准：0级：无心肌损害；1级：1或2个小病灶；2级：数个小病灶；3级：多个小病灶或严重的大病灶；4级：多个大病灶，弥漫性浸润或坏死。

    1.4.2  病毒滴定：采用国际通用的病毒滴定法——PFU（Plaqueforming unit）法，即空斑形成技术定量测定心肌组织内感染性病毒颗粒。①多孔板内单层细胞的制备：将已经长成单层的Hela细胞以0.25%胰酶消化，吹打分散，以105/ml的细胞浓度定量接种在16孔培养板内，5%CO2、37℃培养，24 h后长成单层备用。②心肌组织病毒分离和病毒毒力的滴定：将心肌组织称重后用微量匀浆器进行匀浆，加含有2%小牛血清的1640培养液吹打，以10 000 r/min转速离心，取上清液0.1 ml用PBS以1∶10、20、40、80、160、320、640、1 280进行系列稀释，取各稀释液0.1 ml分别加入已经长成单层的Hela细胞上，5%CO2、37℃培养，每日观察细胞形态变化，倒置显微镜下进行空斑计数。③免疫组化SP法检测心肌组织中CD34的表达：石蜡标本脱蜡，采用微波抗原修复，滴加正常动物血清，过夜，滴加一抗为CD34兔多克隆抗体(1∶100)，4℃过夜，滴加生物素化二抗，再滴加链霉亲和素一生物素化过氧化物酶复合物，DBA显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。用已知显色阳性的心肌切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

    根据Weidner评判标准计数MVD，凡呈现棕黄色单个内皮细胞或内皮细胞群者均作为一个血管计数，肌层较厚及管腔面积大于8个红细胞的血管不计数。先在低倍镜下寻找血管高密度区，再在高倍镜下计数微血管数目。在3个血管最多的区域400倍下进行计数，分别计数每区域5个视野，取均值。

    1.5  统计学处理  各组照片应用Simple PCI图像分析系统分析。采用SPSS11.0 统计软件包进行统计学分析，计量资料以均数±标准差 (x±s)表示，组间比较用方差分析，P＜0.05差异有显著性。

    2  结果

    2.1  一般状况  正常对照组和PD对照组小鼠活动力强，毛色均匀光泽，进食正常，体重逐日增加。接种病毒小鼠在感染2～3 d后，均出现不同程度皮毛不光泽且呈束状，活动、摄食减少，腹泻；病毒接种4～5 d时，病毒对照组小鼠或烦躁不安，相互撕咬，或纳差精神萎靡，开始死亡；PD治疗组症状则相对较轻。14 d后逐渐恢复进食、活动，感染小鼠病情趋于恢复。PD治疗组的小鼠存活率显著高于感染组，见表1（P＜0.05）。表1  各组小鼠生存率

    2.2  心脏大体变化  正常对照组和PD对照组小鼠心脏色泽鲜红，富有光泽。病毒对照组小鼠在接种病毒7 d后，心脏色黯红、肿大，心外膜下可见灶状或片状病变区，心脏外有大量白色膜状渗出物覆盖，白色渗出物擦不掉；PD治疗组比病毒对照组明显减轻,仅见有少量的坏死灶和炎性细胞浸润。

    2.3  心肌病理改变  正常对照组和PD对照组小鼠心肌组织均无病理改变：心肌细胞呈短圆柱状，胞浆丰富而红染，胞核卵圆形，位于细胞中央；心肌纤维之间有薄层结缔组织，核呈梭形，高倍镜下隐约可见横纹；心外膜为核扁平的间皮细胞，紧贴心肌纤维。

    病毒对照组小鼠心肌组织：在感染后3 d心肌就出现异常，心肌细胞出现肿胀、局灶性颗粒变性。第7天可见心肌细胞小灶性坏死，崩解，周围见单核细胞、淋巴细胞浸润。病变于感染后10～14 d时达高峰，心肌实质内散在面积较大的坏死灶，心尖处及室间隔最明显，坏死灶周围有较多炎细胞浸润，主要是淋巴细胞、单核细胞和少量的中性粒细胞，并可见累及心外膜的大块状心肌坏死及心外膜的钙化。21 d后小鼠心肌基本恢复正常，炎细胞消散，部分小鼠心肌纤维化，结缔组织增生，坏死灶形成瘢痕。

    PD治疗组心肌炎症和坏死等病理改变明显轻于病毒对照组，7 d时仅见少数以淋巴细胞为主的炎细胞浸润，胞浆嗜伊红浓染，均质化，微细结构丧失。10 d时可见炎性细胞灶性浸润，有散在心肌细胞坏死。14 d后开始恢复正常。

    各组小鼠心肌病理积分见表2。表2  CVB3感染小鼠的心肌病理积分

    2.4  病毒分离  CVB3感染后3 d心肌已可分离出病毒，7 d时达高峰，10 d后即开始下降，21 d转为阴性。PD治疗组小鼠心肌组织内病毒滴度明显低于病毒对照组（P＜0.05），并且在感染14 d时心肌内已分离不出病毒，说明虎杖甙具有显著的抗CVB3病毒功效。各感染CVB3小鼠病毒检测结果见表3。表3  CVB3感染小鼠的心脏病毒滴

    2.5  计数微血管密度  经CD34免疫组化染色，正常小鼠心肌微血管着色较淡，密度稀疏（图1），而感染组小鼠和PD治疗组小鼠心肌内微血管尤其是心肌毛细血管的管壁可见明显的着色较重的棕黄色环（分别见图2，图3）；计数病毒感染14d时各组每高倍视野微血管个数（表4），发现感染组微血管数目高于正常对照组小鼠（P＜0.05），PD治疗组微血管数目显著高于感染组（P＜0.05）。表4  小鼠心肌微血管密度

    3  讨论

    本实验中，与感染组小鼠相比，PD干预使VMC小鼠心肌炎细胞浸润及坏死显著减轻，存活率增加，提示接种CVB3后早期应用PD对实验性急性VMC有保护作用。PD治疗组小鼠心肌组织内病毒滴度明显低于感染组（P＜0.05），并且在感染14 d时心肌内已分离不出病毒，说明虎杖苷具有显著的抗CVB3病毒功效。

    最新研究发现，PD的有效成分白藜芦醇对参与柯萨奇病毒复制的蛋白酪氨酸激酶PTK中Src亚类家族成员酶pp561ck和pp60csrc活性均有抑制作用，可抑制免疫激活所致的炎症反应和病毒复制［2］。体外抗病毒作用研究发现，虎杖对CVB3具有一定直接杀灭作用，并且可抑制CVB3的生物合成［１］。

    病毒性心肌炎的发病机制主要有二：一是病毒的直接损害作用；二是免疫机制［3］。不管何种机制引起的损伤，都会导致心肌缺血缺氧，心肌缺血缺氧可能同时增加促血管生长因子和抗血管生长因子的产生，共同参与缺血心肌的血管新生过程，维持心肌血管的正常功能状态［4］。其中，最重要的正向调节血管生成因子为血管内皮生长因子(VEGF)［5］。VEGF能作用于全身血管内皮细胞，特异的促进内皮细胞的分裂、增殖和迁移，并在血管发生和血管新生中发挥重要调节作用［6～8］。心包液中抗血管生长因子为内皮抑素 ［4］ 。如果促进因素占主导优势，最终表现为促血管的生成。

    对血管生成的定量分析有许多方法，其中MVD是一个广泛采用的衡量血管发生的定量指标。本实验用CD34抗体标记微血管发现受损心肌周围有大量微血管生成。感染组小鼠心肌组织内微血管数目与正常对照组比较明显增多；PD治疗组心肌微血管不仅较正常小鼠明显增多，与感染组小鼠微血管数目比较也有显著意义。缺血缺氧是病毒性心肌炎重要病理生理过程，低氧条件下内皮细胞的许多生物学特性发生改变，主要表现为增殖受抑制，分化能力下降，并伴有低氧介导的细胞能动性降低，细胞抗损伤的修复能力下降等。PD一方面通过抑制CVB3复制、杀灭CVB3病毒，保护心肌细胞，使心肌受损程度减轻，缺血坏死面积减小；另一方面使血管新生过程中促进因素占优势，大量新生成熟、稳定的微血管的形成可以增加血供，为心肌输送更多的营养，促进炎症消散吸收，增强心功能，提高心肌细胞抗损伤的修复能力，均有利于改善心肌缺血缺氧状态。

    本研究提示，PD有显著的抗CVB3病毒功效，可以增加VMC小鼠心肌MVD，对CVB3感染小鼠有明显保护作用，为PD的进一步研究开发提供了科学依据。但具体通过何途径增高MVD，血管生成的负向调节如何受抑制，正向调节如何被促进，仍有待于进一步研究。

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作者单位：青岛卫生学校 青岛市 266071