乳腺癌中线粒体基因组D环区基因突变的研究

【摘要】  通过检测乳腺癌基因组D环区体细胞突变和种系性变异，探讨其与乳腺癌发生的关系。方法 提取24例乳腺癌患者癌、癌旁组织及外周血细胞总DNA，PCR扩增各组织线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)基因组D环(Dloop)，基因测序后与线粒体文库中的剑桥序列比对，分析突变类型。结果 在24例乳腺癌组织中，共发现91个种系性变异，11例(45.8%)肿瘤发现体细胞突变共19例次，36.8%位于第一高变区，52.6%位于第二高变区。结论 乳腺癌mtDNA D环区具有高度多态性和高度突变率，该区的碱基改变在乳腺癌的形成中可能起重要作用。

【关键词】  乳腺肿瘤 线粒体DNA 突变 多态性

  Study on the relation between mutations in Dloop region of mitochondrial DNA and tumorgenesis of breast cancer

    JIAO Fei1  CHANG Feng2  MA Ying1  et al

    1 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Binzhou Medical University,Binzhou 256603;

    2 Department of Pathology, Shengli Oil Field Central Hospital

    【Abstract】 Objective  To investigate the potential role of mitochondrial DNA mutations in tumorigenesis of breast cancer and to analyze, somatic mutations and polymorphisms of mitochondrial Dloop region in breast cancer.Methods  The Dloop of mitochondrial DNA in tumor samples, paired normal tissues and peripheral blood samples were amplified by PCR and sequenced. The sequences were compared with the Cambridge sequence reported in Mitomap to analyze the mutation types.Results  Ninetyone germline variations were found in total 24 tumors. Eleven tumors (45.8%)presented somatic mtDNA mutations with a total of nineteen. Among them, 36.8% and 52.6% were located in hypervariable segment 1 and 2  respectively.Conclusion  Mitochondrial DNA Dloop has high polymorphisms and high somatic mutations. The variants of the region might play an important role in tumorgenesis of normal breast tissue.

    【Key words】  breast neoplasm,mitochondrial DNA,mutation,polymorphism

    线粒体与肿瘤发病关系的研究,可追溯到20世纪70年代以前,但过去的研究主要集中在肿瘤细胞线粒体的形态和能量代谢等方面,随着研究的深入已经证实，线粒体可参与细胞的多种生命过程［1］。自从Polyak［2］发现结直肠癌中mtDNA基因型的变化以来,mtDNA突变和肿瘤的发生的关系成为近年研究的热点,并且在多种肿瘤中都发现了mtDNA 的突变［35］。Dloop区主要由重链复制的起始区(OH)﹑轻链启动子(LSP)﹑重链启动子(HSP)﹑保守序列片段(CSBⅠ、CSBⅡ、CSBⅢ)和终止结合序列(TAS)组成,又称控制区或非编码区。该区域突变将引起整个线粒体功能的紊乱,直接影响线粒体编码区的功能［6］。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,本文对乳腺癌组织mtDNA 的Dloop区突变进行检测和分析,可为乳腺癌病因学的研究提供实验依据,并为临床乳腺癌的诊断和治疗提供参考。

    1  材料与方法

    1.1  标本来源  搜集24例经病理证实的乳腺导管细胞癌患者的肿瘤组织，癌旁组织为距肿瘤组织边缘5 cm以外的周围正常组织, 病理切片光镜下未见肿瘤细胞, 正常对照为患者经枸橼酸钠抗凝的相应外周血标本。24位患者均为女性，年龄31～69岁，中位年龄52岁。

    1.2  主要试剂  E.N.Z.A组织DNA 盒( Tissue DNA kit) (Omega ) ,E.N.Z.A 血液DNA盒(Blood DNA kit) (Omega) , Takara Premix Taq (Takara)，其它化学试剂均为国产分析级。

    1.3  DNA抽提  用E.N.Z.A组织和血DNA提取试剂盒分别提取乳腺癌组织及其相应外周全血标本和正常对照的外周全血标本的细胞总DNA。

    1.4  PCR扩增及序列测定  引物序列分别为: 上游引物F1:5'GAATCGGAGGACAACCAGTA3',下游引物 R1:5'TGATGTGAGCCCGTCTAAAC3'。它们分别位于mtDNA Cytb 和12S rRNA基因区内,扩增包括1 122 bp控制区序列在内的1 450 bp片段。在PCR反应管中依次加入下列物质:Takara Premix Taq 25 μl,上游引物1 μl,下游引物1 μl,模板DNA 2 μl, 双蒸水补足至终体积为50 μl。PCR扩增: 94℃预变性5 min；94℃变性1 min,55℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,32个循环；72℃延伸10 min。扩增产物5 μl经1%琼脂糖凝胶电泳90V电压下,60 min有目的条带出现后于ABI Prism377测序仪(美国PE公司生产) 上进行DNA测序,测序反应用的引物同PCR反应的引物。

    1.5  序列分析  测序结果用DNASTAR (DNASTAR Inc.)软件的Meqalign 5.00程序进行分析。序列变化与Mitomap database (www.mitomap.org) 标准剑桥mtDNA序列相比较［7］,如发现肿瘤组织mtDNA在D环区的核苷酸顺序与外周血序列不同时,归类为体细胞性突变,如同一病例的肿瘤组织和外周血mtDNA序列相同,而与基因文库记录的序列不同时,记录为种系性变异(多态性),癌旁组织序列仅作为参考以探讨以其作为对照的可靠性，同时分析其序列改变在肿瘤早期发生中的可能意义。

    2  结果

    2.1  乳腺癌患者不同组织样本的PCR扩增结果  用引物F1/R1 PCR扩增不同患者各组织mtDNA,所有样品均扩增出1 450 bp片段，扩增片段大小完全与预期相一致，见图1。

    M: 1 kb Marker

    1、2、3：患者1癌组织、癌旁组织及外周血DNA扩增结果

    4、5、6：患者2癌组织、癌旁组织及外周血DNA扩增结果

    图1  乳腺癌患者不同组织样本的PCR扩增结果

    2.2  乳腺癌患者mtDNA D环区种系性变异(多态性)  本研究中，当乳腺癌组织、癌旁组织及外周血DNA测序结果完全一致时，方确定为种系性变异(多态性)。24例乳腺癌组织中，共发现91个种系性变异，人均变异数为3.8个，平均变异密度为每例每1 000碱基2.62个，所有多态性变异已有报道。

    2.3  乳腺癌患者mtDNA D环区体细胞突变  本研究中，在分析乳腺癌组织、癌旁组织及外周血DNA测序结果时，当癌旁组织与外周血DNA测序结果不一致时，以后者序列为准。24例乳腺癌癌组织mtDNA的D环区经测序并与剑桥序列相比较，共发现11例(45.8%)肿瘤具有体细胞突变，累计共19例次，均为已有报道的突变：其中15个突变为点突变，其中7个为T→C(占点突变的46.7%)，7个为A→G(占点突变的46.7%)，1个为C→A颠换(占点突变的6.6%);另外检测到4处发生了线粒体DNA微卫星不稳定性(mtMSI),其中3处发生在D310区(见表1) 表1  乳腺癌线粒体DNA D环区体细胞突变位点剑桥序列乳腺癌患者癌组织序列乳腺癌患者注：癌旁组织与外周血序列不一致者以粗体标出。

    3  讨论

    目前已证实mtDNA突变可见于多种肿瘤中，其中的主要涉及两个机制：mtDNA突变后的非随即分离和突变引起的凋亡过程改变。前者认为，当细胞内出现mtDNA突变体时,该细胞能量代谢可发生障碍。为维护自身平衡,通过多次有丝分裂,将突变mtDNA分子归集到其中某一子代细胞中(非随机分离),这一细胞最终因严重呼吸缺陷而死亡；而不含突变mtDNA分子的细胞,获得选择性生长优势,从而发生恶变［8］。在凋亡机制中，由于突变可引起线粒体内相关蛋白合成、运输、分布改变，影响内膜通透性及膜电位，使原本与线粒体内膜结合的细胞色素C向线粒体外转移，从而激活内源性凋亡途径［9］。

    由于其自身特点及所处环境的共同作用，mtDNA具有高突变率且尤以D环区最为常见。目前已经有研究证实在正常人群中非相关个体的mtDNA的测序约有50个(0.3%)核苷酸互不相同,绝大部分分布于D环及非编码区［10］。本研究也表明24例乳腺癌组织中,共发现91个种系性变异,人均变异数为3.8个,平均变异密度为每例每1 000碱基2.62个,虽然目前不能明确这些变异与肿瘤的关系,但可见mtDNA的D环区是一个具有高度多态性的区域,由于数据库中的序列信息来源于西方人群，这可能是人种和地域差异的反映。

    D环区最常见的突变集中在两个高发区上,第一个高发区是在D环303～309位点的多聚C区,此区中303位点处于保守序列Ⅱ区(CSBⅡ),是H链的复制起始点；由于D环区的单链启动复制机制,突变可能会使DNA基因部位容易出现发卡样结构,增加了mtDNA多聚酶γ在C区的错配机会,同时303位点是线粒体转录因子A(mtTFA)结合点,mtTFA是核DNA编码的蛋白质,可以结合于线粒体转录因子A结合位点,是高水平特异性转录起始所必须的,此处的突变可能会导致线粒体转录的异常［11，12］。本研究结果也发现在303位点存在3处mtMSI,显示乳腺癌的发生可能与之有关。

    有文献表明［13，14］,在有关mtDNA突变与肿瘤发生的研究中，以癌旁组织为对照是否可靠还有待商榷。以癌旁组织为对照时，尽管镜检时未见明显的癌变迹象，但组织此时是否已经发生分子水平的改变很难确定。考虑到此，本研究分别以患者自身癌旁组织和外周血DNA作为对照,一方面验证癌旁组织作为对照的可靠性,另一方面也从另一个侧面说明mtDNA突变可见于早期的肿瘤发生过程中。由本研究结果可见,总共有3例样本中癌旁组织与外周血DNA序列并不一致(表1中粗体所示)，说明在发生病理学可见的改变之前，mtDNA在分子水平确实有改变发生。

    D环区是线粒体基因组和核基因组信息交换的枢纽，其在mtDNA 的转录和复制的控制中起重要作用。因此,mtDNA非编码区的突变可能与肿瘤细胞中mtDNA 的复制和转录水平的变化有关,至于其分子机制及生物学意义有待于进一步探讨。进一步研究将明确突变发生的热点所在,探明mtDNA不同位点突变所产生的相应生物功能上的异常,这将为肿瘤的早期诊断及药物治疗提供新的理想途径,具有重要的理论与临床意义。

【参考文献】
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作者单位：滨州医学院生物化学与分子生物学教研室 滨州市 256603