阿米替林对缺血损伤神经元bcl2和bax表达的影响

【摘要】  研究阿米替林(Ami)对缺血损伤神经元bcl2和bax表达的影响。方法 分离培养 15～18 d胎龄的大鼠神经细胞，用连二亚硫酸钠消除培养基中的氧合并培养基缺糖模拟细胞缺血性损伤，测定乳酸脱氢酶、一氧化氮、谷胱甘肽过氧化物酶的含量变化，观察缺氧缺糖对神经细胞的损伤及Ami的保护作用，并使用Hoechst 33342荧光染色法、免疫细胞化学染色法观察Ami对原代神经细胞的抗凋亡作用。结果 缺氧缺糖引起神经细胞明显损伤性变化，存活率下降，凋亡率升高，培养上清液中乳酸脱氢酶、一氧化氮含量升高，谷胱甘肽过氧化物酶水平显著降低，促进缺氧神经细胞产生bcl2，并减少bax的产生。Ami 10-7～10-5 mol·L-1能不同程度地减轻上述损伤性变化。结论 Ami对神经细胞“缺血”性损伤有保护作用，其抗凋亡机制可能与增加bcl2表达，下调bax表达有关。

【关键词】  阿米替林 神经细胞 缺氧 凋亡

    Effects of amitriptyline on expression of bcl2 and bax in rats neurons after anoxia

    LU Yonghui  HU Yingbin  XU Yong

    Binzhou Medical University,Binzhou  256603

    【Abstract】  Objective  To study the effects of amitriptyline(Ami) on expression of bcl2 and bax in rats neurons after anoxia.Methods  The injury model of cultured neurons was made by the administration of sodium dithionite and glucosedeprived Earle's solution. The protective effects of Ami in vitro analyzed with MTT reduction assay was observed by determining the content of nitric oxide(NO)by Griess reagent and the activities of lactate dehydrogenase(LDH) and glutathione peroxidase （eGSHPx）by LDH and GSHPx kits, respectively. The antiapoptosis effect of Ami on primary cultured neurons was observed by methods of Hoechst 33342 staining and immunocytochemistry.Results  Ami (10-7，10-6，10-5mol·L-1)  dropped apoptosis rate of cerebral cortical neurons induced by hypoxia, increased bcl2 protein expression and decreased bax protein expression.Conclusion  The results suggest that Ami is able to prevent hypoxic neurons from apoptosis in primary cultured cerebral cortical neurons. The effect of antiapoptosis is through upregulation of bcl2 protein expression and downregulation of bax protein expression.

    【Key words】  amitriptyline，neuron，hypoxia，apoptosis

    脑缺血损伤不仅可以引起神经元急性坏死，还可以导致迟发性神经元损伤。神经元损伤涉及多种因素，微循环障碍导致能量缺乏，氧自由基的大量产生，消耗了细胞中的抗氧化物质，引起或加重了脂质过氧化反应，兴奋性氨基酸释放增多引起细胞钙超载，最终致细胞坏死或凋亡。本研究利用培养大鼠皮层神经细胞，以连二亚硫酸钠（sodium dithionite）消除培养基中的氧合并培养基缺糖建立神经细胞“缺血”模型，观察其对神经细胞的损伤作用，通过测定培养液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,   LDH）活性、一氧化氮（nitric oxide, NO）含量和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPx）含量观察其细胞保护作用，以Hoechst 33342荧光染色法、免疫细胞化学染色法观察其抗凋亡作用，并探讨其抗脑缺血作用的机制。

    1  材料与方法

    1.1  材料  孕15～18 d Wistar大鼠（滨州医学院实验动物中心提供）。盐酸阿米替林、多聚L赖氨酸（分子量为150 000～300 000）、噻唑兰（3［4,5dimethylthiazoyl2yl］2,5dipenthyltetrazolium bromide，MTT）、Hoechst 33342（均为Sigma公司产品）；DMEM高糖培养基、胎牛血清、马血清（均为Gibco公司产品）；连二亚硫酸钠（sodium  dithionite）（天津石英钟厂霸州化工分厂）；盐酸阿糖胞苷（cytarabine  hydrochloride）（上海华联制药有限公司）；LDH、NO、GSHPx试剂盒（均为南京建成生物工程研究所产品）；总蛋白试剂盒（北京中生生物工程高技术公司）；抗兔IgG二抗ABC试剂盒（华美生物，即用型）；兔抗大鼠bcl2和bax多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc）。其余试剂均为市售分析纯。HERA cell 二氧化碳培养箱（德国GmbH公司）；SWCJ1F型净化工作台（苏州安泰空气技术有限公司；BHNICB型倒置显微镜（日本Olympus Optical 公司）；722型分光光度计（上海第三分析仪器厂）；DG5031型酶联免疫检测仪（华东电子管厂）。

    1.2  方法

    1.2.1  胚胎大鼠大脑皮层神经细胞培养［1］：孕15～18 d Wistar大鼠腹腔注射水合氯醛350 mg/kg麻醉，无菌条件下剖腹取出胎鼠，开颅取出大脑皮层放入预冷的DMEM培养基中，剔除软脑膜和血管，将脑组织移入含血清的DMEM培养基（含10%胎牛血清和10%马血清）的小烧杯中，用细口吸管反复轻轻吹打成细胞悬液，以200目不锈钢筛网过滤，并将滤液细胞数调至1×109个/L，接种于经0.01%多聚L赖氨酸过夜处理的细胞培养板中（24孔板接种1ml·孔-1，96孔板接种0.1 ml·孔-1），置37℃，5%CO2培养箱中培养。次日待细胞贴壁后换液1次以去除死细胞，以后每3～4天换液1次。细胞培养至第6天时，加入终浓度10 μmol·L-1阿糖胞苷以抑制非神经细胞的生长，18 h后换新的DMEM培养基继续培养。

    1.2.2  缺氧缺糖对神经细胞的损伤［2］：取培养8～10 d的神经细胞，吸去原培养液，用无糖 Earle's 液（mmol·L-1：NaCl 143，KCl 5.4，CaCl2 1.8，MgSO4 1.0，NaH2PO4 1.0，HEPES 2.4，pH  7.4）洗2遍，每孔加入含连二亚硫酸钠0.5 mmol·L-1的无糖Earle's 液１ml（24孔板），0.1 ml（96孔板），置37℃，5%CO2培养箱中培养24 h。正常对照组用含葡萄糖10 mmol·L-1的Earle's 液孵育。给药组在损伤处理前24 h及处理过程中均加入不同浓度的Ami（10-7、10-6、10-5mol·L-1）。

    1.2.3  MTT微量自动比色［3］：缺氧缺糖损伤细胞后24 h，用MTT染色法测定细胞存活率。96 孔细胞培养板于终止培养前每孔加入10 μl MTT（终浓度为0.5 g·L-1），继续培养4 h后，吸去上清液，加入二甲基亚砜（dimethylsulphoxide，DMSO）100 μl溶解甲肷结晶，待其充分溶解后，用酶标仪测其OD值，检测波长为570 nm。细胞存活率（%）=100%×OD值/对照组OD值。

    1.2.4  LDH和NO的测定：细胞经损伤处理后，收集培养上清液，按文献方法［4，5］，参照试剂盒说明书测定培养液中LDH活性、NO含量。

    1.2.5  培养液中GSHPx含量的测定：细胞经损伤处理后，收集培养上清液，按文献方法［6］，参照GSHPx试剂盒说明书进行操作，测培养液中GSHPx的含量。

    1.2.6  神经细胞Hoechst33342荧光染色：培养的神经细胞加入终浓度为10 μg/ml的Hoechst 33342，在37℃孵育30 min，用1%多聚甲醛固定10 min。将长有细胞的盖玻片封片于载玻片上，于荧光显微镜下观察结果。计数200个细胞,计算凋亡率。

    1.2.7  神经细胞bcl2和bax免疫组化染色：按常规方法操作，抗bcl2或抗bax一抗工作浓度1∶200。

    1.2.8  数据处理方法：计量资料数据用x±s表示，统计处理用SPSS软件作F检验。

    2  结果

    形态学观察显示，大鼠前脑皮层神经细胞培养8～12 d后，胞体呈锥形或多极形，光晕明显，多聚集成团，细胞团之间可见粗大突起连接成神经网络，核不可见。经“缺血”损伤后，细胞突起缩短，胞体折光性下降，颗粒样物质增多。经Hoechst33342荧光染色，活细胞的核、浆呈弥散均匀荧光；凋亡细胞的核或细胞质内可见浓染致密颗粒、块状荧光和核裂解块状荧光。检测培养上清液，发现LDH漏出率、NO含量明显增加，GSHPx活性明显降低。Ami 10-7、10-6、10-5mol·L-1能显著减轻缺血对神经细胞的损伤作用，用药组与损伤组相比，细胞更接近正常形态，细胞存活率、细胞含量增加，NO的生成受到抑制，GSHPx活性明显增强，凋亡率下降，促进缺氧神经细胞产生bcl2，并减少bax的产生。详见表1～3。表1  阿米替林对缺氧缺糖损伤神经元的影响 表2  阿米替林对缺氧缺糖损伤神经元NO、GSHPx的影响（ 表3  阿米替林对缺氧缺糖损伤神经元凋亡率、bcl2和 bax蛋白表达的影响

    3  讨论

    缺氧缺糖培养引起神经细胞损伤是体外模拟脑缺血的常用模型。本研究在缺乏葡萄糖的培养液中加入终浓度0.5 mmol·L-1的耗氧剂连二亚硫酸钠，培养24 h造成了细胞缺氧/缺糖损伤。结果显示，神经元“缺血”性损伤，细胞死亡率及LDH漏出均增高，细胞折光性下降,突起回缩。Ami 10-7、10-6、10-5mol·L-1能显著抑制神经元的这种损伤，这进一步证明Ami对缺血损伤的神经元具有保护作用。

    本实验显示，缺氧缺糖培养的神经细胞，LDH漏出率增加，NO生成增多，细胞存活率和GSHPx下降，这表明在神经元缺氧/缺糖损伤过程中，产生大量氧自由基。Ami 10-7～10-5mol·L-1能不同程度地减少NO生成，降低LDH漏出率和细胞死亡率，提高GSHPx活性，减轻“缺血”对神经细胞的氧化应激损伤，表现出较强的保护作用。

    缺血缺氧时，神经细胞发生能量代谢障碍，自由基产生增加，细胞膜完整性损伤，大量Ca2＋内流均能导致细胞死亡。研究表明［6，7］，脑缺血所致的神经细胞死亡有坏死和凋亡两种方式，迟发性神经细胞死亡以凋亡为主。脑缺血缺氧后有多种基因被诱导表达，有的促进凋亡，有的抑制凋亡，二者表达是否平衡，决定了细胞保护性因素和损伤性因素何者为主。bcl2和bax基因是重要的调往调控基因。当bcl2bax或bcl2bcl2形成蛋白二聚体时抑制凋亡，形成baxbax蛋白二聚体则促进凋亡，因此bcl2和bax表达的量致关重要。bcl2表达增加可拆散baxbax同源二聚体抑制凋亡，反之亦然。Ami 10-7～10-5mol·L-1能不同程度地增加bcl2表达，减少bax表达，因此可以认为Ami对缺血损伤的神经细胞的保护作用的重要途径之一是通过调节凋亡调控基因的表达，改变bcl2/bax的比例，减少细胞凋亡。

【参考文献】
  ［1］ Dildy J，Leslie SW. Ethanol inhibits NMDAinduced increase in free intracellular Ca2+ in dissociated brain cells［J］.Brain Res，1989，499：383386.

［2］ 许勇，姬汴生，高远，等. 米帕明对大鼠皮层神经细胞缺血性损伤的保护作用［J］.中国临床药理学与治疗学，2002，(7)2：134137.

［3］ 孙东旭，张莉，陈学清. 体外细胞增殖和细胞毒试验.见：朱立平，陈学清主编.免疫学常用实验方法［M］.北京：人民军医出版社，2000：191208.

［4］ Kolh JY，Choi DW. Quantitative determination of glutamate mediated cortical neuronal injury in culture by lactated dehydrogenase efflux assay［J］. J Neurosci Med，1987，5(5):8390.

［5］ Keller JN，Kindy MS，Holtsberg FW，et al.Mitochondrial manganese superoxide dismutase prevents neural apoptosis and reduces ischemic brain injury:suppression of peroxynitrite production,lipid peroxidation, and mitochondrial dysfunction［J］. J Neurosci，1998，18(2)：687.

［6］ Shigeno T，Yamaski Y，Kato G，et al. Reduction of delayed neuronal death by inhibition protein synthesis［J］.Nourosci Lett，1990，120：117119.

［7］ Nitatori T, Sato N, Waguri S,et al. Delayed neuronal death in the CA1 pyramidal cell layer of the gerbil hippocampus following transient ischemia is apoptosis［J］.J Neurosci，1995，15(2)：10011011.

作者单位：1 滨州医学院 滨州市 256603；2 滨州医学院附属医院消化内科；3滨州医学院药理学教研室