小分子化合物对人肺癌A549细胞生长抑制作用研究

【摘要】  研究小分子化合物苯并口恶嗪酮衍生物（BOD）对人肺腺癌细胞生长的抑制作用。方法 用不同浓度的BOD处理体外培养的人肺癌A549细胞，应用倒置相差显微镜、MTT分析方法检测A549细胞形态学变化及细胞存活率的变化。结果 BOD使A549细胞明显缩小、变圆；随着药物浓度的增加和处理时间的延长，细胞存活率明显下降。结论 BOD可以抑制A549细胞的生长。

【关键词】  肺癌 细胞生长 苯并口恶嗪酮衍生物

    Research on the effects of small molecules on A549 lung cancer cell growth

    PAN Xiaohong  WANG Juan  YAN Miaomiao

    School of Pharmaceutical Sciences,Binzhou Medical University,Binzhou 256603

    【Abstract】  Objective  To find the inhibition of BOD to human lung cancer cell growth.Methods  After treating A549 cells with different concentrations of BOD , light microscopy and MTT assay were used to determine morphological changes and cell viability respectively.Results  BOD induced the cell shrinkage, and made some cells round. Cell viability decreased with raised concentrations and prolonged treatment of BOD.Conclusion  BOD could inhibited A549 lung cancer cell growth.

    【Key words】  lung cancer cell,cell growth,BOD

    在当今工业化程度较高的国家中，肺癌死亡率居于各种恶性肿瘤之首位［1］。而其中，肺腺癌最常见，发病率最高［1,2］，所以，治疗肺腺癌对于降低肺癌死亡率极为关键。A549细胞系为人肺腺癌细胞系，是体外研究肺腺癌治疗的常用的良好模型［3,4］。因此，A549细胞常被作为一种可靠的模式细胞，用于体外筛选治疗肺腺癌的药物。目前，临床上常用的肺癌治疗药物有环磷酰胺、阿霉素、甲基苄肼、长春新碱、氨甲蝶呤、环已亚硝脲等。虽然上述药物可治疗肺腺癌，但是毒副作用较大，故存在抗药性问题。因此，需要不断开发治疗肺腺癌的新药物。

    有研究报道，一些小分子化合物，如黄樟素氧化物［5］、吡唑羟基酯化合物［6］等，可以抑制A549细胞的生长，引起细胞凋亡，推测该类小分子化合物具有广谱性的抑制癌细胞增殖作用。本文对另一类新合成的小分子化合物苯并口恶嗪酮衍生物（BOD）对A549细胞生长的作用进行了研究。

    1  材料与方法

    1.1  材料  人肺腺癌A549细胞（军事医学科学院第五研究所馈赠），RPMI 1640培养液（美国GIBCOBRL公司），新生小牛血清（山东省医学科学院；杭州四季青生物工程材料有限公司），胰酶（上海生工）。小分子化合物BOD（1～5＃）用二甲基亚砜（DMSO）溶解。

    1.2  细胞培养  人肺癌细胞A549的培养液为含10%小牛血清的RPMI 1640，消化液为0.25%胰蛋白酶加0.02 mol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(1∶1,V∶V)。置于37 ℃，5% CO2 饱和湿度的培养箱中培养。实验中选用对数生长期细胞。

    1.3  实验分组  根据加入的BOD药物浓度不同将细胞分组：①对照组；②溶剂对照组（DMSO）；③加药组（分别为50 μM、100 μM、200 μM）。将各组细胞接种到24孔和96孔板中，每孔细胞浓度为1×104/ml，置于37 ℃，5% CO2 饱和湿度的培养箱中培养24 h后加药，分别于加药后24 h和48 h进行观察和分析。

    1.4  细胞形态学观察  各组细胞加药24 h和48 h后，倒置相差显微镜下观察24和48 h细胞形态变化。

    1.5  MTT法检测细胞琥珀酸脱氢酶的活性  将上述培养于96孔板中的细胞根据实验分组加入不同浓度的BOD，于各组药物处理终止前4 h每孔加入5 mg/ml MTT液20 μl，继续培养4 h，然后小心吸出各孔内培养液，加入100 μl DMSO，振荡至结晶全部溶解，酶标仪上570 nm测定光密度（OD值）。取各平行孔OD值的平均值,根据下式计算细胞相对存活率: 存活细胞(%) = (实验组OD 值/对照组OD 值)×100%(以不含细胞的培养液为空白组调零)。

    1.6  统计学处理  实验数据以x±s表示,经t检验,P＜0.05 表示有统计学意义。

    2  结果

    2.1  BOD对A549细胞形态学影响  A549 细胞经BOD（1～5#，表1）(200 μM)处理24 h后，在倒置显微镜下可见细胞明显缩小，有的细胞变圆，而且细胞的生长均受到抑制，其中BOD 2#、3#和5#处理组的抑制作用尤其明显（图1)。 表1  BOD 1～5# 化合物序号

　　2.2  BOD对A549细胞存活率的影响  观察到细胞形态发生了明显变化之后,为了进一步证明BOD对A549细胞生长的抑制作用，我们用MTT法检测A：对照组；B：BOD 1＃处理组；C：BOD 2＃处理组；了各组BOD处理后琥珀酸脱氢酶的活性变化，发现BOD对A549细胞的影响呈浓度和时间依赖性关系。随药物浓度的增加，细胞存活率降低；随药物处理时间的延长，细胞存活率也降低。其中BOD 2＃、3＃和5＃处理组细胞存活率降低尤其明显，这与形态观察结果一致（表2）。表2  BOD1～5＃化合物对A549细胞存活率的影响注：与溶剂对照组相比*P＜0.05,△P＜0.01,n=3

    3  讨论

    化学遗传学（chemical genetics）是紧密连接化学、生物与医药领域的桥梁。基于传统遗传学筛选原理，化学遗传学方法是利用细胞渗透性的生物活性小分子，直接特异性地与靶分子（蛋白质或核酸）相结合，实时性激活或抑制靶分子功能，由此鉴定在生物学过程中起调节作用的蛋白质或基因，并了解其作用分子机制，也可由此找到有医药价值的小分子［7，8］。化学遗传学的手段是可控的和可逆的，可以随时加入或除去小分子化合物,从而启动或中断特定的反应。大多数小分子化合物对蛋白质的作用非常快,从而可以进行实时检测。此外,通过控制化合物的浓度,可以对其作用的靶分子的动力学过程进行分析。而且一个同样的小分子化合物,可以被广泛地用于影响各种不同生物体的某一种过程或功能。因此，化学遗传学为创新药物的研究提供了新机遇。已有研究报道，一些小分子化合物可以通过抑制癌细胞的生长及引起癌细胞凋亡而起到抗癌作用［9］。

    一些小分子化合物，如黄樟素氧化物、吡唑羟基酯化合物等，可以明显的抑制A549细胞的生长，引起细胞凋亡或坏死。本文的研究结果表明，新合成的5种小分子化合物——BOD，随着浓度的增加和作用时间的延长，细胞存活率逐渐降低，尤以2＃、3＃和5＃化合物作用最为明显；细胞形态学研究结果证明，在BOD作用下，A549细胞明显缩小，细胞密度较对照组明显降低。证明BOD能有效地抑制A549细胞的生长，在一定程度上抑制了肿瘤的恶性程度，可为治疗肿瘤提供一定的理论依据。这一研究结果也为我们下一步的工作，如寻找此化合物作用的靶蛋白，进一步研究其控制细胞增殖、分化的分子机制奠定基础。

【参考文献】
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［3］ Jrvinen K，PietarinenRuntti P,Linnainmaa K,et al.Antioxidant defense mechanisms of human mesothelioma and lung adenocarcinoma cells［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2000，278(4):L696702.

［4］ Bélanger M，Gaudreau M，Roussel,et al. Role of Caveolin1 in Etoposide Resistance Development in A549 Lung Cancer Cells［J］. Cancer Biol Ther，2004，3(10):954959.

［5］ Du AY, Zhao BX, Yin DL,et al.Discovery of a novel small molecule, 1ethoxy3(3,4methylenedioxyphenyl)2propanol, that induces apoptosis in A549 human lung cancer cells［J］. Bioorg Med Chem，2005，13(13):41764183.

［6］ Wei F, Zhao BX, Huang B,et al.Design, synthesis, and preliminary biological evaluation of novel ethyl 1(2'hydroxy3'aroxypropyl)3aryl1Hpyrazole5carboxylate［J］.Bioorg Med Chem Lett，2006，16(24):63426347.

［7］ Schreiber SL. Chemical genetics resulting from a passion for synthetic organic chemistry［J］. Bioorg Med Chem，1998 ，6(8):11271152.

［8］ Tolliday N, Clemons PA, Ferraiolo P,et al.Small molecules, big players: the National Cancer Institute's Initiative for Chemical Genetics［J］.Cancer Res，2006，66(18):89358942.

［9］ Viale M, Mariggio MA, Ottone M,et al. Preliminary evaluation in vitro of the inhibition of cell proliferation, cytotoxicity and induction of apoptosis by 1,4bis(1naphthyl)2,3dinitro1,3butadiene［J］. Invest New Drugs，2004，22(4):359367.

作者单位：滨州医学院药学院 滨州市 256603