薯蓣皂苷类化合物体外抗肿瘤作用的研究

【摘要】  目的 探讨薯蓣皂苷类化合物的体外抗肿瘤作用。方法 用酸性磷酸酶法分别检测五种薯蓣皂苷对人源性肝癌BEL7404细胞株体外生长的抑制作用。结果 五种薯蓣皂苷对所试肿瘤细胞株的体外生长皆有一定的抑制作用，尤其是薯蓣皂苷5对肝癌细胞的生长抑制作用较强，抑制率达到90%以上。结论 体外实验表明五种薯蓣皂苷皆具有一定的抗肿瘤细胞生长作用，其中具有末端β半乳糖基的薯蓣皂苷5抗肿瘤细胞毒活性最高。

【关键词】  薯蓣皂苷；酸性磷酸酶法；抗肿瘤

    Study on antitumor effects of dioscin compounds in vitro

    MA Peng  CAO Tongtao  LIU Dong  et al

    College of Basic Sciences, Binzhou Medical University, Binzhou  256603

    【Abstract】 Objective  To examine antitumor activity of dioscins on tumor cell line in vitro.Methods  Acid phosphatase assay(APA) was adopted to detect in vitro the effects of these drugs on the growth of tumor cell line.Results  Five kinds of dioscins had inhibitory effects on tested tumor cell line. Especially,the growth inhibitory ratio of dioscin 5 on BEL7404 cell line reached above 90%, which was highest among them. Conclusion  Our results revealed that the five kinds of dioscin had potent inhibitory effects on BEL7404 cell line with different degree. Dioscin 5,which has βgalactosyl at the terminal, showed the strongest cytotoxicity on the growth of tumor cell line among them.

    【Key words】  dioscin, acid phosphatase assay(APA), antitumor effect

    薯蓣皂苷（dioscin）属于甾体皂苷，水解可以得到薯蓣皂苷元（diosgenin，Dio），Dio是合成甾体激素和口服避孕药的原料，主要存在于薯蓣科、蔷薇科、石竹科等植物的根茎中，其中尤以薯蓣科含量最多。近年来随着分离提取技术的不断发展，多种薯蓣皂苷被分离出来，并不断发现其新的生物活性，特别是在抗肿瘤、免疫调节、抗炎、降血脂、抗艾滋病等方面的作用引起了人们的重视［1］，为了更好的认识薯蓣皂苷的药用价值，本研究采用5种薯蓣皂苷类化合物对人源肝癌BEL7404细胞株进行抗肿瘤筛查，探讨其体外抗肿瘤作用。

    1  材料与方法

    1.1  主要仪器及试剂  超净工作台（苏净集团生产）、二氧化碳培养箱（Hereus公司）、EL311酶标免疫检测仪（BioTek公司）、相差倒置显微镜（Olympus公司）。薯蓣皂苷类化合物其衍生物由中国科学院生态研究环境中心生物技术室提供，DMSO购自中国医药集团上海试剂公司，阳性对照药顺铂由齐鲁制药厂生产。

    1.2  细胞株  所用细胞株引自北京师范大学生命科学院，本室保存。

    1.3  药物溶液的配制  薯蓣皂苷类化合物以二甲基亚砜（DMSO）溶解，加入细胞前用培养液稀释至0.1～10  μg/ml，其中DMSO最高浓度为0.1％。阴性对照为0.1％DMSO。阳性对照组加入顺铂，最终作用浓度为1～4  μg/ml。

    1.4  酸性磷酸酶法（APA）细胞敏感性筛选实验  细胞传代至对数生长期后，经胰酶EDTA液消化，制成细胞悬液，按1×103/孔的密度接种于96孔板。培养24 h后待细胞完全贴壁后实验组加入先用DMSO溶解、再经RPMI1640培养液稀释至终浓度为1～10 μg·ml-1的薯蓣皂苷；空白对照组加入RPMI1640培养液；溶剂对照组加入经同样稀释的溶剂，含0.01%～0.1%DMSO。实验中每个浓度设8个平行孔，作用72 h后参考文献报道的酸性磷酸酶法（APA）［2］经EL311酶联免疫检测仪在405 nm波长处测定吸光度OD值，空白孔调零，实验重复三次，取平均值。

    1.5  统计处理  所得数据以均数±标准差表示，采用SPSS 10.0统计分析软件包进行统计学处理。

    2  结果

    2.1  薯蓣皂苷作用后对BEL7404细胞形态的影响  BEL7404细胞生长72 h后, 光镜下观察, 未给药组细胞贴壁并呈梭形或多边形生长, 细胞数目多, 铺满整个瓶底, 细胞生长状态较好。薯蓣皂苷高剂量组细胞贴壁状况不好, 部分细胞漂浮在培养液中, 细胞数目较对照组少。培养液中漂浮有细胞碎片, 少数细胞呈圆形贴壁, 细胞生长缓慢, 高倍镜下可见细胞内颗粒物质。

    2.2  细胞敏感性筛选  经体外APA法检测筛选，薯蓣皂苷类化合物对肿瘤细胞生长的抑制作用见表1。薯蓣皂苷1、2对人肝癌细胞株BEL7404的有效浓度从1 μg/ml开始，薯蓣皂苷3、4的有效浓度分别从4 μg/ml、6 μg/ml开始，但薯蓣皂苷1～4在所用药物浓度中对肿瘤细胞生长的最大抑制率均为50%以下。人肝癌细胞株BEL7404对薯蓣皂苷5较为敏感，药物起效浓度为2 μg/ml，其最大抑制率可达到90%以上。表1  薯蓣皂苷类化合物对BEL7404细胞的增殖抑制活性比较  浓度(μg·ml-1)A405nm 值 注：与空白对照相比, *P＜0.05, △P＜0.001

    3  讨论

    当今很多抗肿瘤药物由于开发和原料的关系，费用高昂，其广泛普及受到限制。毒副作用小、成本较低的天然来源活性抗肿瘤药物越来越受到青睐。以北京市为例，植物性抗肿瘤药在抗癌药物中销售量已居首位［3］。薯蓣皂苷是自然界中分布很广的一种天然有机化合物，原料来源广泛，价格低廉。近年来薯蓣皂苷的一些生物活性，特别是在抗肿瘤、免疫调节、抗炎、降血脂、抗艾滋病等方面的作用引起了人们的重视。

    目前已发现很多薯蓣皂苷对多种肿瘤细胞都具有抑制作用或强烈的毒性［4，5］，如从植物柴姜黄（Dioscorea collettii var. hypoglauca）中分离出的薯蓣皂苷、薯蓣皂苷元A和纤细皂苷对子宫癌、K562、BEl7402、HL60等癌细胞株有明显杀伤作用［6］。从百合科百合属Lilium speciosum X.L  nobiissium中分离得到的27CH2OHMGMe薯蓣皂苷元3OαL鼠李吡喃糖基(1→2)O［βD葡萄吡喃糖基(1→4)］OβD葡萄吡喃糖苷在5 μg/ml浓度下抑制活性为40.3%，是laxogenin活性的10倍多［6］。Hu等［7］从薯蓣属柴姜黄中分离到的Protodioscin (NSC698 796)体外试验对60种人的癌细胞具有细胞毒性，其中对白血病、肠癌和前列腺癌细胞最为敏感。

    由于肝癌是国内发病率较高的一类肿瘤，故本研究5种薯蓣皂苷对人源性肝癌细胞株BEL7404的体外抗肿瘤作用进行检测，结果表明5种薯蓣皂苷对所选用的肝癌细胞株均有一定的增殖抑制作用。薯蓣皂苷1、2对人肝癌细胞株BEL7404的有效浓度从1 μg/ml开始，薯蓣皂苷3、4的有效浓度分别从4 μg/ml、6 μg/ml开始，但薯蓣皂苷1～4在所用药物浓度中对肝癌细胞生长的最大抑制率均为50%以下。人肝癌细胞株BEL7404对薯蓣皂苷5较为敏感，药物起效浓度为2 μg/ml，其最大抑制率可达到90%以上。构效关系分析表明，薯蓣皂苷5的末端β半乳糖基可提高其抗肿瘤细胞毒活性。深入研究薯蓣皂苷的抗肿瘤作用，从中筛选新的抗癌药物无疑是一个很有实际意义的课题。

【参考文献】
  ［1］ 王晓鹏,陆羡.薯蓣皂苷生物活性研究新进展［J］. 国外医学中医中药分册, 2004 ,26 (3) :138141.

［2］ 陈学清，杨晓鸥，潘国宗，等.酸性磷酸酶法在体外化疗药物筛选中的应用［J］.癌症,1998,17(6):477478.

［3］ 王佩,李玉珍,齐有利.植物类抗肿瘤药成为市场主导［J］.首都医药,2003,10(5):3334.

［4］ Zengli Yu, Wenjie Li, Fuyun Liu. Inhibition of proliferation and induction of apoptosis by genistein in colon cancer HT29 cells［J］.Cancer Letters, 2004, 215(2):159166.

［5］ Gu G, Du Y, Linhardt RJ. Facile synthesis of saponins containing 2,3branched oligosaccharides by using partially protected glycosyl donors［J］.J Org Chem，2004，69(16):5497500.

［6］ Hu K, Yong AJ , Yan XS ,et al. Antineoplastic agents; I. Three spirostanol glycosides from rhizomes of Dioscorea collettii var. hypoglauca［J］.Planta Medica,1996,62 (1) :573575.

［7］ Hu K, Yao X. Protodioscin (NSC698 796): its spectrum of cytotoxicity against sixty human cancer cell lines in an anticancer drug screen panel［J］.Planta Med，2002 ,68(4):297301.

作者单位：滨州医学院基础学院 滨州市 256603