高同型半胱氨酸血症对球囊损伤大鼠颈动脉核转录因子和单核细胞趋化因子蛋白1表达的影响

【摘要】  目的 观察高蛋氨酸饮食诱导的高同型半胱氨酸（Hcy）血症对大鼠颈动脉球囊损伤后血管组织核转录因子（NFкB P65）蛋白及单核细胞趋化因子蛋白1(MCP1)表达的影响，探讨血管成形术后Hcy对新内膜增生的可能机制。方法 采用免疫组织化学方法分别检测血管组织NFκB P65蛋白和MCP1蛋白表达。结果 低及高蛋氨酸组血管组织NFκB P65蛋白和MCP1蛋白的表达［分别为（12.32±2.37）μmol/L，（21.33±4.32）μmol/L和（26.32±3.34）μmol/L，（33.35±3.87）μmol/L］均高于对照组［（5.17±1.49）μmol/L，（15.78±2.13）μmol/L］ (P＜0.05,P＜0.01),高蛋氨酸组血管组织NFκB P65蛋白和MCP1蛋白表达与低蛋氨酸组比较也有明显差异(P＜0.05);而且血管组织MCP1蛋白表达与NFκB P65蛋白的表达呈显著正相关（r=0.643,P＜0.01）。结论 高Hcy血症能使球囊损伤后颈动脉组织NFкB P65、MCP1 蛋白过度表达；推测同型半胱氨酸有可能通过激活NFκB通路上调血管内皮损伤后动脉组织MCP1蛋白的表达，这可能是其促进血管成形术后新内膜过度增生的机制之一。

【关键词】  蛋氨酸；同型半胱氨酸；球囊损伤；核转录因子；单核细胞趋化因子蛋白

    Effect of hyperhomocysteinemia on the expression of NFkappaB and MCP1 protein after transluminal angioplasty in rat

    XU Huipu  LIU Changmei

    Department of Cardiology,Affiliated Hospital of Binzhou Medical University,Binzhou 256603

    【Abstract】  Objective  To study the effect of homocysteine(Hcy) on the expression of nucler factorkappaB (NFκB)P65 protein and monocyte chemoattractant protein1(MCP1) protein  in rat carotid common artery after balloon injury and explore the possible mechanism for homocysteine exacerbating neointima formation after angioplasty.Methods  The expression of NFκB P65 and MCP1 protein was detected by immunohistochemistry.Results  The expression of NFκB P65 and MCP1 protein was more elevated in LM［（12.32±2.37）μmol/L，（26.32±3.34）μmol/L］ and HM ［（21.33±4.32）μmol/L，（33.35±3.87）μmol/L］groups than that in control group［（5.17±1.49）μmol/L，（15.78±2.13）μmol/L］ (P＜0.05,P＜0.01,respectively).Moreover,the expression of NFκB P65 and MCP1 protein was also significantly higher in HM group than in LM group(P＜0.05).On the other hand ,the expression of MCP1 protein was positively correlated with that of NFκB P65 protein（r=0.643,P＜0.01）.Conclusion  The study suggests that high methinione diet may induce hyperhomocysteinemia and upregulate the expression of MCP1 protein in carotid common artery after balloon angioplasty by the activation of NFκB pathway,this may be one of the mechanisms of  neointimal hyperplasia induced  by hyperhomocysteine after angioplasty.

    【Key words】   methionine,homocysteine,balloon injury,NFkappaB,monocyte chemoattractant protein1

    大量研究表明,血管成形术后再狭窄与新内膜的增生密切相关。单核细胞趋化因子蛋白1（monocyte chemoattractant protein1,MCP1），在血管壁损伤早期即有表达，MCP1是单核细胞的一个潜在的趋化因子，它由内皮细胞和平滑肌细胞激活而产生，已被在人类动脉粥样硬化斑块中检测到。单核或巨噬细胞聚集在损伤的血管壁变成泡沫细胞，聚集的泡沫细胞在动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄的过程中起着潜在的作用。众多文献已表明高同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)血症是心血管疾病的独立危险因素［1］，最近的研究发现高Hcy血症加重了球囊损伤大鼠颈动脉新内膜的增生［2］,然而其在血管内皮球囊损伤后新内膜增生中的具体机制尚不清楚。我们用高蛋氨酸（methionine，Met）饮食诱导高同型半胱氨酸血症，观察其对血管内皮球囊损伤后血管组织核转录因子（NFκB）P65蛋白及MCP1 mRNA表达的影响，探讨Hcy促进血管内皮球囊损伤后新内膜过度增生的可能机制。

    1  材料与方法

    1.1  动物和分组  健康雄性12周龄SD大鼠30只由华中科技大学同济医学院动物中心提供，体重280～320 g。实验大鼠检疫1周后，分三组笼养，对照（C）组10只,给普通饲料;低蛋氨酸(LM)组10只，给1.2%蛋氨酸饲料,高蛋氨酸(HM)组10只，给2%的蛋氨酸饲料;各组均自由进食和饮水，室温控制在（22±3）℃。

    1.2  动物模型建立及标本采集  动物喂养4周后，体重350～400 g,禁食12 h ，用3%的戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉。每只动物采血2 ml,离心15 min，-20℃冻存待测。沿颈前正中线切开皮肤，在颈前三角区暴露左右颈内、外及颈总动脉，结扎左颈外动脉的远心端，用微动脉夹夹住左颈总动脉的近心端及左颈内动脉，切开左颈外动脉的近心端，然后将自制2F的球囊导管自颈外动脉的近心端插入颈总动脉，至起始部，球囊注入生理盐水，使其充分扩张至有轻度阻力感，然后回拉球囊使球囊达颈动脉分叉处，重复三次，完成后负压回抽球囊中的生理盐水，取出球囊导管，结扎左颈外动脉。术后1 h处死动物，并立即取左右颈总动脉液氮冻存备用。

    1.3  主要试剂及仪器  兔抗大鼠NFκB P65多克隆抗体、兔抗大鼠单核细胞趋化因子蛋白1多克隆抗体、即用型SABC试剂盒、DAB显色试剂均购自武汉博士德公司。主要器材：自制2F球囊导管(天津乳胶制品厂)，计算机图象分析系统（上海四星公司），高效液相色谱仪(美国Water公司)。

    1.4  指标检测

    1.4.1  血浆同型半胱氨酸及蛋氨酸测定：每只动物采血2 ml,置于2%EDTANa2的试管中，混匀，半小时内，标本于4 ℃用3 000 r/min离心15 min，分离出的血浆移入相应的EP管，-20 ℃冻存，留做血浆Hcy和蛋氨酸检测。血浆Hcy检测按文献［3］的方法稍作改良，采用高效液相色谱仪测定血浆Hcy水平，所用试剂批内变异系数为＜5%,批间变异系数为＜10％。血浆蛋氨酸测定应用日立83550全自动氨基酸分析仪，采用阳离子交换树脂、分离和茚三酮显色等方法测定。

    1.4.2  血管组织NFκB P65、MCP1蛋白的表达: 应用SABC免疫组织化学染色法，抗体浓度为1∶100。具体步骤严格按试剂盒说明操作。阳性判断标准：以细胞浆着棕黄色为阳性，用计算机图像分析系统，每张组织片随机选5个不重复视野，计算每个视野阳性细胞数，以细胞阳性染色的平均光密度（A值）来表示各蛋白表达量。

    1.5  统计学处理  所有数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用方差分析和q检验，统计处理由SPSS10.0统计软件包完成，P＜0.05为有统计学意义。

    2  结果

    2.1  血浆蛋氨酸和Hcy浓度变化  低及高蛋氨酸组血浆蛋氨酸和同型半胱氨酸浓度均显著高于对照组(P＜0.01),低、高两组之间也有明显差异（P＜0.05），详见表1。表1  各实验组大鼠血浆蛋氨酸和Hcy水平比较注：和C组比较，▲P＜0.01，和LM组比较▼P<0.05

    2.2  血管组织NFκB P65蛋白的表达  免疫组织化学检测，低及高蛋氨酸组NFκB P65染色与对照组相比差异性显著（P＜0.05,P＜0.01）,LM和HM两组之间也有显著性差异（P＜0.05），详见表2和图1～3。表2  免疫组化各组血管组织NFκB P65蛋白表达的比较注:和C组比较，▲P＜0.05，▼P＜0.01；和LM组比较▼P＜0.05

    2.3  血管组织MCP1的表达  低及高蛋氨酸组MCP1免疫组化染色与对照组相比差异显著（P＜0.05,P＜0.01）,LM及HM两组之间也有显著性差异（P＜0.05）,详见表3和图4～6。 表3  各组血管组织MCP1蛋白表达的比较 注：和C组比较 ▲P＜0.005，▼P＜0.01；和LM比较，▼P＜0.05

    2.4  血管组织NFκB P65蛋白表达与MCP1蛋白表达的关系  血浆总Hcy水平与NFκB P65蛋白表达（r=0.581,P＜0.01）及MCP1的表达(r=0.576,P＜0.01)呈显著正相关。MCP1蛋白的表达与NFκB P65蛋白表达也呈显著正相关（r=0.643，P＜0.01）。

    3  讨论

    蛋氨酸为含硫的必需氨基酸，在代谢过程中形成中间产物同型半胱氨酸。如果因先天性酶缺陷或蛋氨酸摄入过多、排泄障碍、营养不良(叶酸、维生素B6及B12摄入不足等)、药物代谢影响等均可导致高Hcy血症。我们的实验结果表明短期给予大鼠高蛋氨酸饲料，不仅可以引起高蛋氨酸血症，还可引起高Hcy血症。Hcy在动脉粥样硬化中的作用已得到大量文献资料的认可，最近的研究发现高Hcy血症加重了球囊损伤大鼠颈动脉新内膜的增生［2］，但其在血管内皮球囊损伤后新内膜过度增生中的具体机制目前尚不清楚。

    本实验涉及的NFκB P65是NFκB家族/Rel家族的重要组成成员之一，目前研究显示，在细胞中最常见的形式为P65及P50组成的NFκB异二聚体，正常情况下与其抑制物IκBα结合，存在于正常细胞的的胞浆内，多种刺激信号，如细胞因子、氧自由基、细菌和病毒产物等可以引起IκBα的磷酸化和降解，NFκB脱离NFκB: IκBα复合体，迅速移位于核内，与特定的基因启动子区的κB结合位点结合，诱导基因的表达［4］，如细胞因子、原癌基因、黏附分子等。我们的实验比较了NFκB P65蛋白在低及高蛋氨酸组和对照组大鼠颈动脉球囊损伤后血管组织中的表达，结果发现低、高蛋氨酸两组的表达与对照组有明显差异（P＜0.05,P＜0.01）,且低高蛋氨酸两组之间也有显著差异（P＜0.05）。提示NFκB可能参与了Hcy诱导血管内皮损伤后新内膜过度增生的过程。Hcy激活NFκB的途径可能有：①Hcy可以引起细胞钙内流和/或细胞内质网释放钙，导致胞浆钙离子浓度增高，进而激活钙依赖性PKC通路，从而对IκBα mRNA的表达产生抑制效应，使IκBα的合成减少，NFκB从其异二聚体解离成为有活性的P65亚型。②Hcy作用于平滑肌细胞使其产生超氧化物，从而刺激IκBα的磷酸化和降解，使NFκB激活，P65蛋白的表达上调。

    研究发现有许多细胞，包括单核/巨噬细胞、血管平滑肌细胞等，在动脉粥样硬化及血管成形术后血管新内膜增生的病理生理过程中起着关键的作用，许多细胞因子和黏附分子调整这些细胞的病理生理和激活过程。其中MCP1是参与这个过程的重要复合因子之一。MCP1除对单核细胞有趋化作用外，对T淋巴细胞和血管平滑肌细胞也有趋化作用［5］。Ikeda 等［6］报道，MCP1增加大鼠主动脉血管平滑肌细胞间黏附分子的表达；另一研究也表明MCP1对培养的大鼠血管平滑肌细胞有直接的促有丝分裂作用［7］。近来已有研究表明在血管平滑肌细胞表面有MCP1受体存在,从而有利于MCP1诱导损伤血管平滑肌细胞增殖和迁移及功能变化，参与血管成形术后新内膜的增生过程。血管成形术后血管损伤处新内膜过度增生是导致血管再狭窄的重要原因，其中血管平滑肌细胞的异常增殖和迁移是造成内膜增厚、新内膜形成和血管再狭窄的重要环节。采用不同浓度的Hcy培育离体血管平滑肌细胞发现，Hcy有刺激平滑肌细胞增殖的作用，且呈浓度时间依赖性，但对血管内皮细胞的作用正好相反，有抑制内皮细胞增生促进其凋亡的作用［8］，其具体作用机制尚不清楚。最近有研究表明Hcy能诱导单核细胞向血管壁内皮细胞的趋化,可能与早期动脉粥样硬化及血管成形术后再狭窄事件有关［9，10］。

    本实验在体研究发现，Hcy可以使血管损伤后血管组织MCP1的表达明显高于对照组，且随血浆Hcy浓度的增高，其表达也明显增高；说明Hcy促进血管平滑肌细胞增殖及迁移，可能是通过增加MCP1的过度表达而实现的。我们的实验还发现，内皮球囊损伤血管组织MCP1 mRNA的表达与NFκB P65蛋白的表达呈正相关（r=0.643，P＜0.01）。说明Hcy激活MCP1的高表达可能是通过激活NFκB通路，但关于Hcy、NFκB、MCP1信号传递途径相当复杂，尚需进一步研究证实。

    总之，我们的研究提示高蛋氨酸饮食能引起高Hcy血症，高Hcy能刺激球囊损伤血管组织NFκB P65及MCP1蛋白的高表达，而Hcy激活MCP1高表达的前提有可能是NFκB通路的激活；这可能是Hcy促进血管成形术后新内膜增生的机制之一。

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作者单位：滨州医学院附属医院心内科 滨州市 256603