钙超载、钙结合蛋白D28k与脑缺血关系的研究进展

【关键词】  钙结合蛋白D28k；脑血管疾病；兴奋性氨基酸

脑血管疾病是当代危害人类健康的最重要疾病之一 ，在临床上具有发病率高、致残率高、死亡率高的特点，严重影响人们的生活质量。其发病机制非常复杂，至今未能完全阐明。现认为参与脑缺血损伤的分子机制有兴奋性氨基酸、钙离子稳态失衡、自由基的形成、蛋白酶的激活、基因表达的改变等多方面，其中钙超载是神经细胞缺血缺氧后继发性损伤的重要环节，它是诸多原因引起的细胞损害的“最后共同通路”［1］，而许多减轻缺血性脑损伤的治疗策略都直接或间接地以胞内Ca2+超载为主要作用目标。实验显示某些钙离子鳌和剂结合过高的钙离子，保护神经元免受兴奋攻击作用［2］，对脑缺血有神经保护作用。钙结合蛋白就是近年来人们非常感兴趣的能够调控细胞内钙离子浓度的一类鳌和剂。它与胞内游离钙离子浓度有密切关系，与缺血性脑损伤有直接关系。本文就近年来钙超载、钙结合蛋白D（CalbindinD）28k与脑缺血关系的最新研究进展作一综述。

    1  钙超载（钙稳态失调）

    正常情况下，细胞处于一个钙稳态的动态平衡中，这种钙稳态对于维持细胞生理功能发挥有重要的意义，钙离子(Ca2+)是最重要的“第二信使”，它在细胞的生理活动、神经元结构功能完整［3］ 等方面起着至关重要的作用。Ca2+对细胞的各种代谢过程极为重要，一旦神经元内Ca2+浓度的稳态失调，出现钙超载，神经细胞将发生变性、死亡［4］。而脑缺血时,神经元发生缺血缺氧，细胞内钙明显增高，这可能与以下因素有关:①脑缺血时细胞能量代谢受阻，ATP合成减少，离子泵失效， 钙排除受阻，造成电压依赖性Ca2+通道开放以至大量Ca2+内流；②脑缺血时，引起兴奋性氨基酸释放增加，作用于NMDA受体，并使受体依赖性Ca2+通道开放，引起大量Ca2+内流；③ 胞内Ca2+增加，可激活磷脂酶C(PLC)产生甘油二酯、前列腺素和三磷酸肌醇(IP3)等，使胞内Ca2+库释放，从而进一步加重Ca2+超载情况；④同时由于Ca2+内流，使黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶，促使大量自由基产生，而大量自由基必然直接攻击脑细胞膜脂质，使膜脂质过氧化受损伤，而影响膜通透性及离子转运，进一步引起Ca2＋内流；⑤再者脑缺血时,脑组织中增加的多巴胺、5羟色胺、乙酰胆碱亦可促使脑细胞Ca2+内流及胞内Ca2+释放，大量自由基生成，破坏了细胞膜对钙的屏障功能，大量钙流入细胞内；⑥脑缺血时蛋白激酶C(PKC)的激活通过多种途径参与了钙内流［5］，如直接修饰钙通道、促进自由基的生成、消耗ATP等方式使钙急剧升高。

    2  CalbindinD28k的概述

    近年来，随着对胞内蛋白研究进展，人们发现钙结合蛋白在细胞内与Ca2+结合、调节钙平衡、保护细胞免遭损伤等方面有一定意义。

    钙结合蛋白(Calcium binding protein,CaBP)是一组具有“EFhand”保守结构的酸性蛋白超家族，在细胞内以多拷贝形式存在，并与钙离子高选择亲合性地结合，该家族包括Calmudin 、Calretinin、Calcineurin、Parabutin、CalbindD28k及Calpain等两百多种蛋白质，可分为两大类:一类属于激发型，如钙调蛋白、肌钙蛋白C，它们与钙离子结合后发生迅速扭曲变形，与靶分子结合，进而调节其活性；另一类属缓冲剂型，如CalbindinD，存在于胞内，主要参与胞内钙离子浓度的调节。而CalbindD28k是其家族重要成员之一，它对缓冲和运输细胞内异常升高的Ca2+浓度起到了积极作用。

    2.1  CalbindinD28k生理特点  1966年 Wasserman和Taylor发现了维生素D依赖的钙结合蛋白(CalbindinD)［6］。CalbindinD有两型，即平均分子量为9 000的CalbindinD9k及28 000 的CalbindinD28k。CalbindinD28k是由261个耐热的酸性蛋白氨基酸残基组成多肽链，能与一些阳离子结合，它对钙具有较高的亲和力，是细胞正常生长发育所必需的蛋白质［7］。至今CalbindinD9k仅在哺乳动物中发现，而CalbindinD28k存在于许多物种中，如鸟类、爬行动物、哺乳动物（鼠、猴、人），在肠中、肾脏、骨胳、胰腺、胎盘及脑分布，在神经系统中广泛分布于大脑皮质、海马、小脑、纹状体黑质及周围神经系统。在哺乳动物的新皮质，其主要在2、3层的锥体神经元和中间神经元中；在海马，其存于CA1、CA2锥体神经元的部分亚群及所有的齿状颗粒神经元中［8］，在小脑只存在于Purkinje细胞中。它主要存在于胞浆、特殊神经元的轴突及某些脑区神经元的树突，近年来还发现于细胞核［9］。

    Celio于1990年首先对CalbindinD28k在大鼠神经系统的分布进行了系统观察，研究结果显示，CaBP既存在于长轴突神经元中，也存在于部分脑区中的短突神经元。同时对大鼠海马CA1 、CA2、CA3区的CaBP阳性细胞的观察，发现 CA1区阳性细胞密度高CA2、CA3区。而胡亚卓等［10］发现CalbindinD28在老年人海马CA1、CA3中均有表达，但有差别，CA1区的免疫阳性细胞数多于CA3区。

    2.2  CalbindinD28k生理作用  近年来人们一直在探讨CalbindinD28k的作用功能，并做了大量的体内体外的实验，但由于钙离子调节的复杂性及CalbindinD28k动态作用，其在脑缺血中具体的功能机制不甚清楚。CalbindinD28k的免疫反应在神经元所有部分均可检测到，提示它能调节整个神经元钙水平的作用；它在神经元中存在，却与任何神经递质没有明确联系，提示它在调节脑内钙的作用可能与含钙结合蛋白的神经元的某个生理反应有关，可能在突触事件中起作用，保护神经元免遭电压依从性钙浓度过高的损害；它高亲和力结合、缓冲、运输钙离子［11］，阻止其过度蓄积，对于调节钙离子浓度，维持钙稳态可能具有重要的意义。

    近年来的研究还表明，神经元内CalbindinD28k水平不仅部分反应钙离子的变化，而且与神经元结构和功能的完整性密切相关［12］，它通过与钙的结合而调节钙依赖的酶的活性，而与神经元的发育及死亡、脑缺血和神经变性疾病等的关系较为密切［13］，例如舞蹈病、震颤麻痹，及老年性痴呆、脑缺血、酒精毒害、癫痫［14］等神经元变性的多种疾病与其分布密切相关。还有研究表明鼠肾的CalbindinD28k在体外能激活Ca2+Mg2+ATP酶活性，提示CalbindinD28k有可能作为一种酶的调节物而发挥其生理功能。

    3  钙超载、CalbindinD28k与脑缺血的关系

    Ca2+超载可通过以下途径引起及加重脑缺血缺氧损害：①细胞内钙超载时，大量Ca2+沉积于线粒体，干扰氧化磷酸化过程，能量产生发生障碍；②胞内钙超载可致胞浆内或溶酶体内Ca2+依赖性酶类和磷脂类大量激活，可使细胞膜结构分解，神经元骨架被破坏，细胞死亡；③细胞内Ca2+升高激活PLA2和PLC，使膜磷脂降解，产生大量游离脂肪酸。特别是花生四烯酸（AA）在代谢过程中产生血栓素、白三烯等物质，同时产生大量的自由基，加重细胞损伤；其也可激活血小板，使其内Ca2+增加，形成微血栓，在缺血区微血管床中增加梗死范围，加重脑损伤；④脑缺血时，脑血管平滑肌、内皮细胞均有明显Ca2+内流增加，前者可使血管痉挛，梗死灶扩大；后者可使内皮细胞收缩，内皮间隙扩大，血脑屏障开放，产生血管源性脑水肿。

    研究表明降低脑血细胞内Ca2+的超载程度，对脑缺血有一定的保护作用。而CalbindinD28k能激活Ca2+/Mg2+ATP酶活性，阻止脑内Ca2+过度蓄积，在神经元内起钙缓冲作用，缓冲和运输细胞内异常升高的Ca2+浓度，是维持钙稳态不可缺少的重要因素。许多实验表明，钙结合蛋白通过它的钙缓冲作用，能明显减轻缺血缺氧对神经细胞的损伤［15］，而增加细胞内钙结合蛋白含量会降低细胞对损伤的敏感性，抵抗兴奋性毒作用，可起到神经保护作用。而缺血会导致钙结合蛋白表达明显减少，使细胞钙缓冲能力下降［16］，另外研究发现钙结合蛋白基因表达的降低，能增加对兴奋性毒的敏感性，导致神经元钙平衡失调，从而导致钙离子介导的细胞毒作用。在细胞培养系统中亦已揭示，含有CalbindinD28k的神经元能更好地降低细胞内游离Ca2+水平，抑制兴奋性毒作用。如没有足够容量去缓冲胞浆游离Ca2+，对一些正常的兴奋性刺激也会产生Ca2+诱导的神经毒作用。在鼠和人的老化进程中，伴随着细胞内游离Ca2+的增加，Ca2+/Mg2+ATP酶活性降低以及线粒体储钙能力降低，这些可能与CalbindinD28k mRNA表达降低有关。

    而通过基因工程技术使CalbindinD28k在缺血神经元内过度表达，来观察其是否具有保护神经细胞免于钙离子介导的损伤作用，他们将表达的基因片断接合到HSV( herpes simplex virus)病毒的质粒载体上，然后转染到大鼠海马和纹状体的神经元中，在神经元受到缺血或缺血样攻击(低血糖，谷氨酸和红藻氨酸诱导的兴奋毒)，过度表达的CalbindinD28k，神经元的受损数量明显少于对照组，由此证实CalbindinD28k对神经细胞的抗缺血作用；同样McMahon等人也通过转基因技术使PC12细胞表达不同水平的CalbindinD28k，具有保护神经细胞免受缺血及MPP诱导的神经变性损伤作用，他们还提出CalbindinD28k神经保护功能不仅仅是因为CalbindinD28k的钙离子缓冲作用，还可能包括CalbindinD28k具有调节其他保护功能蛋白基因转录的作用；另外Kindy等人用腺病毒表达CalbindinD28k的实验也证实CalbindinD28k在脑缺血中保护海马CA1区神经元的作用。

    研究发现一些药物及因素保护大脑细胞的作用是通过影响CalbindinD28k表达而拮抗钙超载实现的，如Silva等［17］发现雌激素对慢性脑缺血的神经元具有一定的神经保护作用，需要依赖于钙结合蛋白阳性神经元的变化实现的张京钟等［18］用电针对大鼠局灶性脑缺血脑内的CalbindinD28k表达施加影响，发现大鼠局灶性脑缺血后在梗死灶坏死区几乎测不到CalbindinD28k，而在半影区反应性增强，可能缓冲胞内过多的游离钙离子； 最近研究显示，纳洛酮对缺氧大鼠的皮层神经元有保护作用［19］，纳洛酮可以通过阻断L型钙道和 N甲基 D天冬氨酸受体减少钙内流 ［20］，可能还与通过钙结合蛋白作用，抑制钙超载有关［21］。于洋等［22］在研究纳洛酮对钙结合蛋白表达的影响以探讨纳洛酮的神经保护作用中，发现纳洛酮预处理组及后处理组免疫组化结果CalbindinD28k阳性神经元百分率明显高于对照组(P＜0.05)。电镜结果表明对照组、纳洛酮预处理组及后处理组都有组织损伤形态学表现，纳洛酮预处理和后处理组损伤程度轻于对照组(P＜0.05)，可以推测，纳洛酮可能是通过促进CalbindinD28k表达或减少其丢失，由此缓冲细胞内过多的钙离子,抑制钙超载，从而减轻缺血/再灌注对神经元的损伤。另外还有董利军等［23］通过实验认为纳洛酮可能通过促进神经元内钙结合蛋白表达或抑制其丢失而抑制钙超载，减轻组织损伤，对改善脑功能、促进脑复苏具有一定作用，但是Klapstcin等对表达缺陷大鼠的研究却使这个问题复杂，他们发现缺乏CalbindinD28k基因大鼠的海马神经元在受到缺血攻击时的损伤程度要小于正常表达大鼠神经元，提示其在脑缺血也可能扮演一个有害的角色，但这个结果亦可能是由于缺乏基因的神经元细胞内存在目前未知的其他的神经保护系统所造成的。总之，目前作用还未完全明确。

    4  展望

    综上所述，钙超载在缺血性脑损伤中处于极其重要的地位，在临床上如何减轻钙超载，中和过多的钙离子内流是改善脑缺血关键的问题。近年来随着人们对CalbindinD28k进行深入的研究，其作为神经元内维持钙稳态的重要组成成分已得到公认，但是它是如何发挥其生理功能，对胞内钙离子具体的调节机制及与细胞内其他成分的相互作用，还需要我们进一步研究。通过基因工程技术使体内过度表达CalbindinD28k来减少神经细胞内的钙离子水平，进而提高神经细胞抗钙介导损伤的能力还是得到证实，这种基因治疗方法为脑缺血后的脑功能保护及恢复开辟了新的领域。

【参考文献】
  ［1］ 赵艳玲,蔡光明,刘军等.正交试验法优选小鼠四氯化碳肝损伤模型［J］.解放军药学学报,2001,17(4):215217.

［2］ 于洋，俞丽华.钙结合蛋白D28K与脑缺血/再灌注损伤［J］.脑与神经疾病杂志，２００４，24（6）：465466.

［3］ Xu J, He L, Wu LG.Role of Ca2+ channels in shortterm synaptic plasticity［J］.Curr Opin Neurobiol, 2007,17(3):352359.

［4］ Sadowski M, Lazarewicz JW, JakubowskaSadowska K,et al.Longterm changes in calbindin D(28k) immunoreactivity in the rat hippocumpus after cardiac arrest［J］.Neurosci Lett,2002,321:9094.

［5］ Selvatic R, Marino S, Piubell C,et al,Protein kinase C activity ,translocation ,and selective isoform subcellurlar redistribution in the rat cerebral cortex after in vitro ischemia［J］.Neurosci Res,2003,71:6471.

［6］ Mcmahon A, Wong BS, Iacopino AM.CalbindinD28k buffers intracellular calcium and promotes resistance to degeneration in PC12cells［J］.Brain Res Mol Brain Res,1998,54(1):56.

［7］ Airaksinen MS, Thoenen H, Meyer M. Vulnerability of midbrain dopaminergic neurons in CalbindinD28k deficient mice［J］.Neuroscience,1997,9(1):120.

［8］ Lazarewicz JW, Rybkowsk W, Sadowski M,et al.CalbindinD28k in nerve cell nuclei［J］.Neurosci Res,1998,51:7684.

［9］ German DC, Ng MC, Liang CL,et al.CalbindinD28k in Nerve Cell Nuclei［J］. Neuroscience,1997,81( 3):735.

［10］ 胡亚卓,张红红,许丹,等.钙结合蛋白在老年人海马CA1和CA3区的分布［J］.中华老年心脑血管病杂志,2004,6(2):101103.

［11］ SutooD,Akiyama K,Yabe K.Comparison analysis of distributions of tyrosine hydroxylase,calmodulin and calcium/calmodulin dependent protein kinase in a triple stained slice of rat brain［J］.Brain Res,2002,933(1)：111.

［12］ Yilmaz H,Erkin E,Mavioglu H.Effects of estrogen replacement therapy on pattern reversal visual evoked potentials［J］.Eur Neurol,2000,7(2):217221.

［13］ Greene JRT, Radenahmad N,Willcock GK,et al. Accumulation of calbindin in cortical pyramidal cells ageing :a putative protective mechanism which fails in Alzheimer’s disease［J］.Neuropathol Appl Neurobiol,2001,27:33934.

［14］ 许念桂，肖波，杨国帅，等.钙结合蛋白与颞叶癫痫大鼠海马神经元易损性的关系研究［J］.中风与神经疾病杂志，2008, 25(1):2529.

［15］ Phillips RG,Meier TJ,Giuli LC,et al. Calbindin D28k gene transfer via herpes simplex virus amplicon vector decrease hippocampal damage in vivo following neuroxic insults［J］.Neurochemistry，1999,73:12001205.

［16］ Sadowski M, Lazarewicz JW, JakubowskaSadowka K,et al.Longterm changes in calbindinD28k immunoreactivity in the rat hippocampus after cardiac arrest［J］. Neurosci Lett，2002, 321:9094.

［17］ Silva A, Montague JR,Lopez TF,et al.Growth factor effects on survival and developnment of calbindin immunopositive cultured septal neurons［J］.Brain Res Bull,2000,51(1):3542.

［18］ 张京钟,施静,刘晓春,等.电针对大鼠局灶性脑缺血脑内CalbindinD28k表达的影响［J］.中国针灸，2002，22(1):4346.

［19］ 宋扬,沈洪,丁爱石,等.纳洛酮对缺氧大鼠皮层神经元细胞的保护作用［J］.中华急诊医学，2004,13（2）:155157.

［20］ Hemstapat K,Monteith GR, Smith D,et al.Morphine3glucuronide’ neuroexcitatory effects are mediated via indirect activation of NmethylDaspartic acid receptor:mechanistic studies in embryonic cultured hippocampal neurons［J］.Anesth Analag，2003,97(2):494505.

［21］ Yang TT,Hung CF, Lee YJ,et al.Morphine inhibits glutamate exocytosis from rat cerebral cortex nerve terminals(synaptosomes) by reducing Ca2+ influx［J］.Synapse,2004,51(2): 8390.

［22］ 于洋,潘曙明,孟庆刚, 等.纳洛酮对全脑缺血大鼠的神经保护作用研究［J］.中风与神经疾病杂志，2005,22(3):271.

［23］ 董利军 ，于洋，潘曙明, 等.纳洛酮对SD大鼠循环骤停后脑功能的保护作用［J］.中国临床康复，2005,9(3):6870.

作者单位：1 泰安市岱岳区第二人民医院 泰安市 271036；2 泰安市中心医院