p53、p27及mdm2在胃肠道间质瘤中的表达

【摘要】  目的 研究p53、p27和mdm2蛋白在胃肠道间质瘤（GIST）中的表达及其与GIST生物学行为的关系，为预测该肿瘤的侵袭潜能提供理论依据和可能的预测指标。方法 收集68例手术切除的GIST标本,应用免疫组织化学法检测肿瘤组织中p53、p27和mdm2蛋白的表达，并结合病理形态学及生物学行为评价进行统计学分析。结果 68例GIST中p53、p27和mdm2蛋白阳性表达率分别为75%、54.41%和27.94%。p53阳性表达率在极低度侵袭危险性（VLR）、低度侵袭危险性（LR）和高度侵袭危险性（HR）组三组间，细胞核分裂数≤10/50 HPF和＞10/50 HPF 两组间的差别均有统计学意义（P＜0.05），在肿瘤直径≤5 cm和＞5 cm两组间差异有高度统计学意义（P＜0.01）； p27阳性表达率在VLR、LR和HR组间比较有统计学意义（P＜0.05），在肿瘤直径≤5 cm和＞5 cm两组间差别有高度统计学意义（P＜0.01）；mdm2阳性表达率在细胞核分裂数≤10/50HPF和＞10/50HPF 两组间比较差别有统计学意义（P＜0.05）。结论 p53、p27和mdm2蛋白表达与GIST的发生、发展有关, 检测p53、p27及mdm2表达可以作为GIST生物学行为评价的有效指标。

【关键词】  胃肠道间质瘤；p53；p27；mdm2；免疫组织化学

The expression of p53, p27 and mdm2 in gastrointestional stromal tumor

    LI Hongwei  JI Xiangrui  ZHAO Jie  et al

    Department of Pathology,Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003

    【Abstract】  Objective  To investigate the expression of p53，p27 and mdm2 protein in gastrointestinal stromal tumor (GIST) , and discuss the relationship between their expression and clincopathological characteristics.Methods  Immunohistochemical staining was used to detect the expression of p53，p27 and mdm2 in 68 cases of GIST.Their relations with histomorphology and biological behavior were analyzed statistically.Results  In 68 cases GIST, the positivity of p53，p27 and mdm2 protein were 75%，54.41% and 27.94% respectively.The expression of p53 protein was inversely correlated with the fletcher degree , morphologic variant (P＜0.05) and tumor diameter(P＜0.01) of GIST. The expression of p27 protein was inversely correlated with the fletcher degree (P＜0.05) and tumor diameter of GIST (P＜0.01) . The expression of mdm2 protein was inversely correlated with the morphologic variant (P＜0.01) of GIST.Conclusion  These data shows the expression of p53，p27 and mdm2 are related to the ontogenesis and progression of GIST. p53，p27 and mdm2 may be prognostic indicators in GIST.

    【Key words】  gastrointestinal stromal tumor，p53，p27，mdm2，immunohistochemistry

    p53是目前研究最为广泛深入的抑癌基因之一, 而mdm2为近几年发现的一种(小鼠)双微体癌基因，二者表达的相关性日益受到关注。p27属CDKI基因（细胞周期素依赖性激酶抑制剂），是CDK的负性调控因子，也是一种抑癌基因。CDKI其蛋白的低表达与多种肿瘤的不良预后密切相关。胃肠道间质瘤（GIST）是一种并非少见、特征为CKIT突变阳性的间叶源性肿瘤，它主要发生在胃肠道，但也可发生在其他腹腔盆腔部位，其临床生物学行为表现复杂，部分呈明显良性过程，部分呈肯定的恶性表现。

    有关p53、p27及mdm2在GIST中的表达，目前国内少见报道。因此，检测GIST中p53、p27及mdm2的蛋白表达，分析其与临床病理特征的关系，了解p53、p27及mdm2在GIST发生、发展中的有指导作用。

    1  材料与方法

    1.1  材料来源  收集青岛大学医学院附属医院病理科2005—2008 年手术切除的GIST肿瘤组织蜡块共68例，临床和病理资料完整；其中男32 例(47.06%)，女36 例(52.94%)，中位年龄59.8 岁（33～103 岁）；病变部位分布：胃34例(50%)，肠20例(29.41%)，其他14例(20.59%)。肿瘤直径大于5 cm 34例（50%），小于5 cm者34例（50%）；按组织学分型：梭形细胞型50例（73.52%），上皮样细胞型9例（13.24%），混合细胞型9例（13.24%）；按肿瘤核分裂像数≤10/50 HPF 55例（80.88%），核分裂像数＞10/50 HPF 13例（19.12%）。按Fletcher分级标准［1］，7例(10.29%)为极低度侵袭危险性（VLR）、20例(29.41%)为低度侵袭危险性（LR）、14例(20.59%)为中度侵袭危险性(IR) 、27例(39.71%)为高度侵袭危险性（HR）。所有组织标本均经10％中性福尔马林固定、石蜡包埋、制成4 μm厚连续切片4张；常规苏木素伊红染色1张；p53、p27及mdm2免疫组织化学染色3张。选取15例取自胃肠道肿瘤大体标本肿瘤远端组织作为正常对照组。

    1.2  免疫组化试剂来源及染色方法  鼠抗人p53单克隆抗体工作液、鼠抗人p27蛋白单克隆抗体工作液、鼠抗人mdm2单克隆抗体原液0.1 ml、PV二步法检测试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。采用PV法进行免疫组化染色,用已知阳性片和磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗分别作为阳性和阴性对照。p53、p27及mdm2免疫组化实验均需热修复，mdm2免疫组化实验一抗浓度1∶100。

    1.3  结果判定标准  p53和p27蛋白在GIST的表达定位于肿瘤细胞的细胞核，mdm2蛋白的表达定位于肿瘤细胞的细胞核和细胞浆。出现棕黄色颗粒或弥漫的棕黄色为阳性细胞。记分参照Remmele and Stegnerde的IRS(Immunoreactive score)法［2］，即3个参数半定量计数方法：根据染色强度、阳性细胞数和两者计分的乘积进行判断，分为阴性“－”、弱阳性“＋”、中强阳性“＋＋”、强阳性“＋＋＋”。每张切片随机选取10个高倍镜视野，计数阳性细胞数：阳性细胞数≤5%为0分；阳性细胞数6%～25%为1分；阳性细胞数26%～50%为2分；阳性细胞数51%～75%为3分；阳性细胞数≥75%为4分。阳性细胞的着色强度：淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。两积分相乘，0分为阴性（－），1～4分为弱阳性（＋），5～8分为中度阳性（＋＋），9～12分为强阳性（＋＋＋）。

    1.4  统计学分析  免疫组化结果采用SPSS11.5统计学软件进行数据处理，采用卡方检验，校正卡方检验及精确检验法分析p53、p27及mdm2蛋白表达与GIST临床病理指标的关系。P＜0.05表示差别有统计学意义。

    2  结果

    2.1  p53、p27及mdm2蛋白表达  68例GIST中p53阳性者51例（75%），p27阳性者37例（54.41%），mdm2蛋白表达阳性者19例（27.94%）。在对照组中，p27蛋白表达阳性率为93.33%（14/15），p53 和mdm2均呈阴性表达。p53 和mdm2在GIST中的表达阳性率显著高于对照组（P＜0.01；P＜0.05），p27在GIST中的表达阳性率显著低于正常对照组（P＜0.01）。免疫组化结果见图1～3。

    2.2  p53、p27及mdm2蛋白表达与临床、病理特征的关系。

    2.2.1  p53与 GIST临床病理特征的关系：68例中，p53阳性表达率在GIST的Fletcher分级中，其VLR、LR组分别与HR组比较差异有统计学意义（P＜0.05）,三组阳性率分别为14.29%、70%和92.59%；在肿瘤直径≤5 cm和＞5 cm两组的阳性率分别为58.82%和91.18%，差别有高度统计学意义（P＜0.01）（表1）；细胞核分裂数≤10/50 HPF和＞10/50 HPF 两组的阳性率分别是69.09%和100%，差别有统计学意义（P＜0.05）（表1）。p53的表达在男女两者之间差异无统计学意义（P＞0.05)；与肿瘤的组织学分型，部位和有无坏死的差别无统计学意义（P＞0.05）。

    2.2.2  p27与 GIST临床病理特征的关系：68例中，p27阳性表达率随肿瘤侵袭危险程度的增加而有降低的趋势，其VLR和LR组分别与HR组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），三组阳性率分别为85.71%、70%和33.33%；在肿瘤直径≤5 cm和＞5 cm两组的阳性率分别为70.59%和38.24%，两组比较差异有高度统计学意义（P＜0.01）（表1）。p27的表达在男女两者之间差异无统计学意义（P＞0.05)；与肿瘤的组织学分型、核分裂像数目、部位和有无坏死的差别均无统计学意义（P＞0.05）。表1  p53、p27及mdm2表达与肿瘤直径和核分裂像的关系p53阳性阴性Pp27阳性阴性Pmdm2阳性阴性

    2.2.3  mdm2与 GIST临床病理特征的关系：68例中，mdm2阳性表达率在细胞核分裂数≤10/50HPF和＞10/50HPF 两组的比较差异有统计学意义（P＜0.05），两组的阳性率分别为21.82%和53.85%（表1）。mdm2的表达在男女两者之间差异无统计学意义（P＞0.05)；mdm2的表达在GIST的Fletcher分级，肿瘤的组织学分型、部位和有无坏死的差别均无统计学意义（P＞0.05）。

    3  讨论

    p53是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因,50%以上的人类肿瘤都检测到p53基因的突变。野生型p53基因为肿瘤抑制因子，突变型p53则具有癌基因活性。野生型p53蛋白分子的半衰期短，不易检测。由异常（突变型）p53基因编码的突变型p53蛋白有较长的半衰期，容易通过免疫组化检测到。本研究结果显示，p53蛋白在GIST中的表达明显高于在正常对照组中的表达（P＜0.01），表明p53基因突变及其产物的积累与GIST的发生关系密切。p53蛋白表达在极低度侵袭危险性（VLR）GIST和低度侵袭危险性（LR）GIST的表达均低于高度侵袭危险性（HR）GIST的表达，其阳性表达率随肿瘤侵袭危险程度的增加而有升高的趋势，这与Gumurdulu等［3］的研究结果相同，此结果表明，伴随GIST Fletcher分级升高，p53表达也升高，突变型p53基因失去原有的生长抑制功能，获得增殖、转化和致瘤潜能，其高表达可以促进GIST细胞的增殖和恶性转化，提示p53基因突变在肿瘤细胞恶性进展中起一定作用，有可能成为临床判定GIST风险程度分级的重要参考指标。同时，p53在不同核分裂像数和不同大小的GIST中表达有差别，核分裂像数和肿瘤直径是公认的判断GIST良恶性的指标，因此，我们认为p53可以作为判断其良恶性的可靠指标。

    p27属CDKI基因（细胞周期素依赖性激酶抑制剂），是CDK的负性调控因子，也是一种抑癌基因。CDKI其蛋白的低表达与多种肿瘤的不良预后密切相关。p27蛋白表达缺失或降低可导致肿瘤的发生。本研究发现，p27蛋白在GIST的阳性率较正常组织低（P＜0.01），说明GIST中明显存在p27 蛋白表达缺失或降低，证实p27 在细胞正常分化中起重要作用，p27蛋白表达水平的降低与GIST的发生有关, 且随着GIST Fletcher分级升高, p27表达降低［4］，证明p27是具有抑癌作用的细胞周期负调控因子, 在GIST进展过程中, 随着表达的逐渐下调, 功能逐步丧失, 肿瘤细胞更具侵袭力, 恶性程度更高。应用免疫组化技术测定GIST中p27蛋白的表达情况，可作为GIST生物学行为的指标，对判断肿瘤的恶性程度及预后具有重要的参考意义。另外，本研究结果还显示p27在不同大小的GIST中表达差异有高度统计学意义（P＜0.01）,更进一步说明p27作为GIST良恶性判断指标的可靠性。p27是p53基因下游调控因子, 其表达受野生型p53的诱导。本实验研究表明, p53蛋白表达随着肿瘤风险分级升高而升高,而p27阳性表达率随着肿瘤风险分级升高而降低, 推测两者在GIST的发生发展过程中可能存在一定的协同关系，也有可能两者表达无相关性，而在GIST的发生发展过程中分别独立的起作用。

    mdm2为近几年发现的一种(小鼠)双微体癌基因。mdm2是p53蛋白的负调控因子，一方面p53 基因激活了mdm2基因的表达；另一个方面mdm2促进p53 磷酸化形式的降解，抑制p53 基因转录活性。已有研究结果表明, mdm2与一些肿瘤的发生发展密切相关［5］。本研究mdm2蛋白在GIST中的表达明显高于正常对照组（P＜0.05），表明mdm2参与了GIST的形成过程，推测mdm2表达过强可封闭p53介导的反式激活作用,使p53功能丧失,导致基因的不稳定及细胞增生,从而表现出癌基因蛋白的作用,参与肿瘤形成。另外，mdm2阳性表达与GIST核分裂像计数有关（P＜0.01），核分裂像数是公认的判断GIST良恶性的指标之一，有关GIST预后指标的几项研究中，核分裂像计数被着重强调。因此，考虑mdm2可作为判断GIST良恶性的指标之一。mdm2和p53之间的关系是目前研究热点之一。一般认为，mdm2水平升高时会导致抑癌蛋白p53功能的丧失，mdm2过表达只发生在野生型p53阳性病例中，而在突变型p53病例中很少有mdm2的表达。我们的研究结果显示，在GIST中既有mdm2的过表达又有p53的突变，说明在GIST中p53的突变和mdm2的过表达可以同时发生，其它肿瘤中有与此相似的研究结果［6，7］。本研究68例GIST中p53与mdm2均阳性者14例，提示两者在GIST的发生发展中有一定的协同作用。推测肿瘤细胞内突变型p53的大量积聚能促进mdm2基因的表达，而mdm2并不能使稳定性增强的突变型p53降解，最终可以引起肿瘤组织内mdm2和p53蛋白均出现过度表达。p53与mdm2均阳性的14例GIST中有10例为高度侵袭危险性（HR），提示p53与mdm2的协同表达阳性者对GIST生物学行为的判断意义更高。

    GIST临床生物学行为表现复杂，难以判断其良恶性及预后。p53、p27及mdm2都是与细胞周期调控相关的重要因子，且三者表达均与GIST细胞的增殖和分化有关，p53与mdm2共同阳性表达对GIST生物学行为有重要的判断意义。因此，检测p53、p27及mdm2表达可以作为GIST生物学行为评价的有效指标。

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作者单位：1 青岛大学医学院附属医院病理科 青岛市 266003；2 广饶县人民医院泌尿外科