丁酸钠诱导结肠癌Lovo细胞凋亡及其对p53靶基因的调控

【摘要】  目的 观察丁酸钠对结肠癌Lovo细胞p53的三个重要靶基因 ，p21waf1、Bax和Gadd45的调控，进一步探讨其抑制细胞增生、诱导细胞凋亡的分子机制。方法 Lovo细胞常规培养分别用1.25、2.5、5.0、10 mmol/L丁酸钠进行干预。用MTT法检测细胞增生，流式细胞仪测定细胞凋亡和细胞周期； AnnexinVFITC/PI 双标记观察细胞凋亡；RTPCR和Western blotting分别检测丁酸钠对p21waf1、Bax和 Gadd45三种基因mRNA和蛋白的表达。结果 丁酸钠以剂量和时间依赖的方式抑制Lovo结肠癌细胞的增生，诱导其凋亡,并阻滞Lovo细胞停滞于G2/M期。p21waf1、Gadd45和Bax基因 mRNA和蛋白的表达增加，其中以Gadd45的表达变化最明显。结论 2.5 mmol/L以上浓度的丁酸钠以剂量和时间依赖的方式，抑制结肠癌Lovo细胞增生，诱导凋亡；丁酸钠参与结肠癌Lovo细胞周期的调控，2.5 mmol/L以上浓度的丁酸钠可以引起Lovo细胞的G2/M期阻滞；丁酸钠的上述作用可能与其调控Lovo细胞中p21waf1、Bax 和Gadd45基因的表达有关。

【关键词】  Lovo结肠癌细胞；丁酸钠；细胞凋亡；p53靶基因

Study of sodium butyrate for inducing apoptosis and regulating some target genes of p53 on Lovo cell

    LIU Chengxia1  ZHANG Shangzhong2

    1  Department of Digestive Medicine，Binzhou Medical University,Binzhou 256603

    2  Department of Digestive,Shandong University QiLu Hospital

    【Abstract】  Objective  To observe the regulation of sodium butyrate on the  three main target genes of p53 ,including p21waf1,Bax and Gadd45,and to explore the molecule mechanism of its  inhibiting proliferation and inducing  apoptosis of Lovo colon cancer cells.Methods  The colon cancer cell line Lovo was cultivated in different concentrations of NaBT which concentrations were 1.25mmol/L，2.5 mmol/L，5.0 mmol/L，10 mmol/L respectively. MTT was used to detect the cellular proliferation. The apoptosis was examined by both flow cytometry and Annexin VFITC/PI double tagging. RTPCR and Western blotting  were used to study the expression of p21waf1,Bax,and Gadd45 messenger ribonuclcic acid(mRNA) and that of the protein.Results  Sodium butyrate inhibited proliferation， induced apoptosis，and blocked Lovo cell mainly in G2 phase in a time and dosedependant manner. The expression of p21waf1, Bax and Gadd45 gene was all enhanced after being treated with sodium butyrate both at mRNA and protein levels, and the expression of Gadd45 was the most obvious of all.Conclusions  Sodium butyrate above 2.5 mmol/L may inhibit proliferation, induce apoptosis and blocked Lovo cell mainly in G2 phase in a time and dosedependant manner. Maybe the effect associated with its upregulating the expressions of p21waf1,Bax and Gadd45 within Lovo cell.

    【Key words】  Lovo colorectal cancer cell line, sodium butyrate, cell apoptosis ,p53 target genes

    丁酸钠是膳食纤维在肠道厌氧菌作用下产生的一种四碳短链脂肪酸（丁酸）的钠盐。研究发现，它可以对许多体外培养的哺乳动物细胞产生多种生物学作用。本研究选择携带野生型p53基因的结肠癌Lovo细胞株为研究对象，通过分析丁酸钠对Lovo细胞p53基因的三个主要下游基因，即p21waf1、Bax和Gadd45的调控，旨在进一步探讨其抑制细胞增生、诱导细胞凋亡的分子机制。

    1  材料与方法

    1.1  细胞培养及试剂  结肠癌Lovo细胞株购于山东省医学科学院。常规培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，37℃、5% CO2 ，饱和湿度的培养箱中。丁酸钠（Sigma公司产品）：用0.1 M PBS配制成0.4 mol/L的储存液（pH=7.2），冰盒保存备用。AnnexinVFITC凋亡检测试剂盒（BioVision公司产品），引物由上海博亚生物公司合成。P21waf1鼠单抗、Gadd45兔多抗和Bax兔多抗均为Santc Craze产品。

    1.2  MTT试验检测细胞活力  收集处于对数生长期的Lovo细胞，以含10%小牛血清的RPMI 1640培养液调细胞密度为5×104/ml,加到96孔板内，每孔加入200 μl。培养24 h后，实验组分别加入1.25、2.5、5.0、10 mmol/L丁酸钠，对照组分别加入等量PBS。每个浓度每个时间接种8个复孔。经丁酸钠处理12、24、48、72 h后，每孔加入MTT 20 μl，继续培养4 h后，弃上清，每孔加入二甲基亚砜150 μl，振荡10 min后，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值，绘制细胞生长曲线。

    1.3  流式细胞仪分析细胞周期和凋亡  收集不同浓度丁酸钠作用0、24、48和72 h的Lovo细胞。调整细胞密度为1×106个/ml,加入碘化丙啶染色液，室温避光染色30 min，FACS Vantage流式细胞仪检测各组细胞DNA含量的变化。应用计算机细胞周期分析软件计算出各时相分布的百分比。

    1.4  Annexin ⅤFITC/PI检测凋亡  离心收集5×105个细胞后，悬浮于500 μl的结合缓冲液中，加入5   μl的Annexin VFITC和5 μl的PI，室温避光孵育5 min，流式细胞仪分析。

    1.5  RTPCR检测 p21waf1，Gadd45和Bax mRNA的表达  按照产品说明书，分别提取经 5 mmol/L丁酸钠作用0、24和48 h的Lovo细胞的总RNA，取5 μg RNA进行逆转录反应合成cDNA。以βactin为内参照，分别取3 μl模版进行PCR反应。

    p21waf1（497bp）：NM000389，上游：GGATTACTTGGGCCTCTTGG，下游：ATGTCAGAACCGGATGCTGGG；Gadd45（500bp）：NM001924，上游：ATGACTTTGGAGGAATTCTCGG，下游：CCATCACCGTTCAGGGAGATA；Bax（656bp）：NM004324， 上游：TCAGACACGTAAGGAAAACGC，下游：ATGGACGGGTCCGGGGAGCAGC；βactin（317bp）: NM001101，上游：ATCATGTTTGAGACCTTCAAAA，下游：CATCTCTTGCTCGAAGTCCA。

    1.6  Western blotting检测  p21waf1、Gadd45和Bax 蛋白的表达  分别提取经 5 mmol/L丁酸钠作用0、24和48 h的Lovo细胞的蛋白，取50 μg蛋白上样，电泳40～60 min，30 mA电流转膜4 h后，5%的脱脂牛奶封闭3～4 h，加一抗，4℃过夜，洗膜后加二抗，室温孵育1 h，DAB显色。

    1.8  统计学分析  采用SPSS11.0软件对数据进行t检验分析，以P＜0.05判定为有统计学差异。

    2  结果

    2.1  细胞形态学观察  正常培养的Lovo细胞大多呈星状生长，表面有细长足突，细胞核大而亮，贴壁生长，见图1。丁酸钠作用后，细胞表面细长的足突回缩，细胞变成圆球状。随着丁酸钠浓度升高和作用时间延长，细胞逐渐脱壁、漂浮。图2为5 mmol/L丁酸钠作用48 h后的Lovo 细胞。10 mmol/L 丁酸钠作用48 h后，细胞脱壁、漂浮。

    2.2  丁酸钠对Lovo细胞生长曲线的影响  2.5、5和10 mmol/L丁酸钠组，在加药后12、24、48和72 h观察均显示出明显的生长抑制作用，与对照组比较，差异有显著性(P＜0.01）（图3）。

    2.3  丁酸钠对Lovo细胞周期分布的影响  随着丁酸钠浓度的升高，处于G2/M期的Lovo细胞比例逐渐增多，与对照组比较有显著性差异（P＜0.001），两两比较亦有显著性差异（表1）。表1  不同浓度丁酸钠作用48 h后Lovo细胞周期的分布 #▲P＜0.001；△#P＜0.001；▲P＜0.001

    2.4  流式细胞仪检测SubG1峰  分析凋亡率2.5 mmol/L、5 mmol/L和10 mmol/L丁酸钠组，在实验24  h、48 h和72 h均显示明显的促凋亡效果，与对照组相比差异有显著性（P＜0.01）（表2）。表2  不同浓度丁酸钠对结肠癌Lovo 细胞凋亡率

    2.5  AnnexinⅤ/PI检测早期凋亡  AnnexinⅤ/PI检测到，培养24 h后，对照组Lovo细胞的早期凋亡率为1.61%，晚期凋亡率为5.69%，总凋亡率7.3%；5 mmol/L丁酸钠组Lovo细胞的早期凋亡率14.56%，晚期凋亡率为20.57%，总凋亡率35.13%，两组比较差异有显著性（P＜0.01）。

    2.6  RTPCR结果  对照组Lovo细胞未检测到p21waf1、Bax和Gadd45mRNA的表达。与对照组相比，1.25 mmol/L丁酸钠组三种基因均未见明显的变化。2.5 mmol/L以上浓度组则显示出比较明显的表达增强，其中p21waf1和Gadd45 mRNA的表达变化较明显。丁酸钠对p21waf1和Gadd45表达的调控作用最早在用药后12 h观察到，24～72 h之间表达较稳定。2.5 mmol/L以上浓度的丁酸钠对三种基因表达的调控呈现出时间和浓度依赖性（P＜0.01）。

    2.7  Western blotting结果  丁酸钠作用后,Lovo细胞p21waf1和Gadd45蛋白的表达呈现出浓度和时间依赖性（图4A、B）。

    3  讨论

    抑制肿瘤细胞生长是抗肿瘤药物的重要作用机制之一。研究发现［1］，丁酸钠可以通过多种途径发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用。在本研究中，我们观察到2.5 mmol/L以上浓度丁酸钠对Lovo细胞的增殖抑制作用表现出浓度、时间依赖性，与Hague等［2］的研究结果相同。

    细胞周期在细胞增殖、凋亡中的调控作用对于维护基因组的稳定性具有重要意义。本研究应用流式细胞仪观察到随着丁酸钠浓度的升高，处于G2/M期的Lovo细胞比例逐渐增高，各组间相比有显著性差异。相似的结果也出现在对人类结肠癌细胞［3］和膀胱癌细胞［4］的研究中。肿瘤的发生、发展及转归均与细胞凋亡有着密切的关系。诱导肿瘤细胞凋亡是近年来肿瘤学领域的研究热点。本研究应用流式细胞仪分析了丁酸钠作用后Lovo细胞的凋亡率，发现2.5 mmol/L以上丁酸钠组的凋亡率明显高于对照组。同时利用AnnexinⅤFITC/PI双染色更敏感、更直观的观察到丁酸钠对Lovo细胞凋亡的影响,得出了与Wilson［5］和Ruemmol［6］等相似的研究结果。

    诸多实验结果已显示出丁酸钠对多种肿瘤细胞的生长抑制、细胞周期调控和促凋亡作用，但是，其确切的作用机制仍不清楚。近年来，多数学者把丁酸钠的这些效应归因于其对组蛋白乙酰化状态的调节。通过这种调节丁酸钠可以引起大约2%的哺乳动物细胞的基因转录发生改变［7］，其中包括许多与细胞周期调控、细胞凋亡有关的基因。

    p53、p21waf1和Gadd45都是细胞周期重要的调控基因，p53基因主要是通过激活其下游基因，如p21waf1、Gadd45和Bax等实现其细胞周期调控、DNA复制与修复和细胞凋亡［8］等功能。Ito等［9］用丁酸钠处理人胶质瘤细胞，发现丁酸钠可以显著诱导其表达p21waf1。本研究观察了丁酸钠作用前后Lovo细胞p21waf1表达的变化，发现2.5 mmol/L以上丁酸钠组表现出明显的p21waf1表达增强。提示丁酸钠可以调节多种肿瘤细胞p21waf1的表达，并由此发挥抗肿瘤作用。

    Bax在p53介导的细胞凋亡中发挥重要作用。目前关于丁酸钠对Bax基因的调控以及Bax在丁酸钠诱导凋亡中的作用，研究结果不尽一致。如对葡萄膜黑色素瘤细胞［10］、人胶质瘤细胞［11］ 的研究，均未观察到丁酸钠对Bax表达的影响。而Gillenwater等［12］在对头颈部鳞状细胞癌和Chung等［13］对肝癌细胞凋亡的研究中证实丁酸钠可以诱导Bax蛋白表达的升高。本研究采用RTPCR和Western blot方法，在Lovo细胞中检测到了Bax mRNA和Bax蛋白，并观察到丁酸钠可以诱导Bax表达，得出了与Levy等［14］相似的结论，推测丁酸钠诱导Lovo细胞凋亡的作用可能与促进其Bax表达有关。

    Gadd45基因直接受p53调控，是连接p53和下一级细胞凋亡相关基因的重要中间环节。实验证明［15，16］，Gadd45可以诱导许多细胞G2/M期阻滞，在应对DNA 损伤的反应中起着关键性作用。本研究中，2.5 mmol/L以上丁酸钠组Gadd45显示出明显的表达增强。由此推断，丁酸钠引起Lovo细胞的G2/M期阻滞可能与其上调Gadd45的表达有关。但目前有关丁酸钠与Gadd45关系的研究报道较少，有必要继续研究两者之间的相互作用，进一步探索丁酸钠的抗肿瘤机制。

    上述研究结果表明，丁酸钠可以抑制结肠癌Lovo细胞的增生，促进凋亡;丁酸钠参与结肠癌细胞周期的调控，2.5 mmol/L以上浓度的丁酸钠可以引起Lovo细胞的G2/M期阻滞。丁酸钠的上述作用可能与其调控Lovo细胞中p21waf1、Bax 和Gadd45基因的表达有关。

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作者单位：1 滨州医学院附属医院消化内科 滨州市 256603；2 山东大学齐鲁医院消化科