急性呼吸窘迫综合征相关基因的研究

【关键词】  急性呼吸窘迫综合征；肺表面活性物质相关蛋白；Toll样受体；血管内皮生长因子

急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是指严重感染、创伤、休克等肺内外疾病袭击后出现的以肺泡毛细血管损伤为主要表现的临床综合征，属于急性肺损伤（acute lung injury，ALI）的严重阶段或类型。其特征性病理表现为肺泡内液体渗出和透明膜形成，导致广泛肺泡实变，临床特征包括呼吸频速和窘迫，进行性低氧血症，X线片呈现弥漫性肺泡浸润［1］。ALI/ARDS的发生发展过程伴随着多个基因的特异性表达，研究这些特异性表达的基因对于阐明ALI/ARDS的发病机制具有重要意义，并且这些基因有望成为今后个体化治疗的靶点。现已发现了许多这方面的相关基因，具体阐述如下。

    1 肺表面活性物质相关蛋白(surfactantassociated protein,SP)

    肺表面活性物质（pulmonary surfactant，PS）缺乏或(和)功能障碍是ARDS发病中的重要环节之一。肺表面活性物质主要是由肺泡Ⅱ型细胞合成、贮存及分泌，可以显著降低气道中气液界面的表面张力，维持肺泡的稳定性，防止肺泡和细支气管在呼气末萎陷，保持气道的开放状态，降低气道中的液体在极细小的支气管腔中阻塞的可能性。肺表面活性物质由磷脂（PL）、蛋白质和中性脂肪组成。PL约占PS总重量的85%～90%，蛋白质约占PS总重量8%～10%，其中80%是血清蛋白，另外是特异性肺表面活性蛋白［2］。

    SP被认为是肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤的标志，分为SPA 、SPB、SPC和SPD。SPA为最先发现且在肺泡Ⅱ型上皮细胞(简称Ⅱ型细胞)中强烈表达、含量最为丰富的蛋白。SPA与ARDS严重程度呈负相关，SPA含量下降可作为ARDS敏感标志，甚至可作为急性肺损伤高危患者预警和预后指标。同时，因SPA的含量变化先于X胸片改变，故它可用于肺疾病疗效监测［3］。有研究表明，SPA的表达受多种因素的影响。如Planer等人研究发现糖皮质激素通过影响SPA的翻译和SPA mRNA稳定性而影响SPA的表达。地塞米松在低浓度(＜10 nmol/L)时增加SPA mRNA的水平，高浓度(100 nmol/L)时则减少SPA mRNA及SPA水平，这种效果是可逆的，是由糖皮激素受体介导［4］。

    SPB在正常肺/表面活性物质的功能中起着必不可少的作用，成熟的SPB肽贮存在板层体内，并分泌到气道中。Lyra等 ［5］研究表明，SPB加速了表面活性物质磷脂吸附和进入表面单层的速率，加快了表面活性物质功能的形成。Quaseney等［６］研究发现，SPB的基因多态性与ARDS严重程度相关，其中SPB + 1580 CC基因型发生ARDS及脓毒性休克可能性较高。

    2  Toll样受体（Tolllike receptors，TLRs）

    TLRs是机体感知微生物病原体并激活细胞直接产生免疫防御的天然免疫受体［7］。它通过识别病原体,能立即启动先天性免疫,并能通过信号传导启动获得性免疫,在机体的免疫防御中起重要作用［8］。目前已发现TLR家族共有11个受体,分布于各个器官脏器,针对不同的病原体或独立或联合发挥其识别病原体的作用。通过信号传导可促进细胞因子的合成和释放,促进和抑制炎症反应;促进免疫细胞的成熟和分化,并表达相关的免疫分子,调节免疫反应［9］。

    ALI/ARDS患者主要的死亡原因并非原发病因而是失控性炎症反应所继发的多脏器功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS) 。在ALI/ARDS的失控性炎症反应中, Toll样受体及其所调控和诱导的细胞因子、化学介质是ALI/ARDS免疫应答和炎症反应最重要的生化机制之一。TLRs家族以TLR4 的结构与功能的研究最为深入,后者与ALI/ARDS的免疫应答及炎症反应也最为密切［10］。

    TLR4是脂多糖（LPS）受体，识别侵入体内的革兰阴性细菌并启动炎症反应。 其激活将引起一系列下游分子的活化，并活化通用转录因子NFκB、API等最终引起以TNFα、IL1等为中心的促炎症因子激活，放大炎症效应，导致多种炎症因子的瀑链式释放，形成第二打击力量而产生生物学损伤效应［11］。Togbe等 ［12］研究发现TLR4基因表达水平决定了由内毒素诱导的急性肺损伤的严重程度，因此可将TLR4基因作为免疫治疗内毒素诱导的急性肺损伤的靶点。

    TLRs位点的单核苷酸多态性（SNP）与炎性应答损伤和感染性疾病的遗传易感性相关，目前多数研究表明TLR2的Arg753Gln和Arg677Trp多态性与感染性疾病的发生相关。Arbour等首先通过对白种人中的TLR4(Asp299Gly)多态性进行分析, 发现人TLR4基因的Asp299Gly和Thr399Ile多态性与吸入LPS后低应答相关, 增加了由革兰阴性菌引起的脓毒血症的易感性。在这些人中,上皮细胞对LPS的刺激免疫应答能力减弱。进一步研究发现Asp299Gly比Thr399Ile更能影响TLR4的功能［13］。Lorenz等研究了Asp299Gly和Thr399Ile位点多态性在革兰阴性细菌引起的中毒性休克中的作用,发现部分患者存在TLR4基因Asp299Gly的位点突变, 而没有Thr399Ile的位点突变［14］。婴幼儿严重呼吸道合胞病毒支气管炎与这两种位点突变均显著相关［15］。因此,TLR4 SNPs与革兰阴性菌败血症及某些病毒感染存在一定相关性。在哮喘患者中,基因的Asp299Gly和Thr399Ile多态性与疾病的发病率无相关性,但Asp299Gly与病情的严重程度有明显的相关性［16］。

    最近的研究表明, TLR2基因多态性是增加对感染性疾病易感性的危险因素之一。Lorenz等［17］通过PCRSSCP方法发现了TLR2一个位于保守C端的新的SNP位点, 在753位上导致精氨酸和谷氨酰氨的替换，对HEK293细胞转染TLR2753Gln基因后, 发现对细菌的脂肽反应性下降，提示Arg753Gln(G2408A)可降低巨噬细胞对细菌多肽的反应能力。因此,不同的TLR2基因型有可能影响不同个体的TLR2表达水平和功能差异,进而影响到宿主免疫反应性的下降。

    3  血管内皮生长因子(VEGF)

    血管内皮生长因子(VEGF)是一种肝素结合生长因子，能促进内皮细胞增殖，增加血管通透性，刺激血管生成。肺是体内VEGF的最大的来源，VEGF在肺内主要由肺泡Ⅱ型上皮细胞表达，气道上皮细胞、气道平滑肌细胞、活化的肺泡巨噬细胞和中性粒细胞也可表达［18］。

    急剧的肺内炎症、肺泡内皮细胞和上皮细胞损伤是引起ALI和进展为ARDS的重要因素。内皮损伤以及毛细血管通透性增加对肺水肿形成的重要性已达成共识［19］ 。

    肺是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)生理性的水池，VEGF可能是一把锋利的双刃剑，当紧密的上皮屏障被破坏时，VEGF会带来巨大的破坏作用导致肺水肿［20］。有研究显示，VEGF是目前发现的最强烈的血管通透因子。它在直接调节多种器官系统血管对水及蛋白通透性中发挥了重要作用。ALI时肺泡上皮受损，内皮细胞直接暴露于高水平的VEGF，VEGF引起血管内皮通透性再次增高，进一步加重肺水肿。VEGF可能在ALI的形成过程中起着重要的作用［21］。Kaner等［22］发现急性肺损伤时，VEGF杂乱地分布在内皮细胞，增加肺血管的通透性，导致肺水肿。VEGF的超表达也导致肺毛细血管渗漏和肺水肿。Hamada等［23］应用抗VEGF基因治疗博莱霉素诱导的肺疾病鼠，能减轻肺损伤和肺纤维化。

    此外，许多研究表明在急性肺损伤和ARDS中，VEGF对肺有保护作用，参与修复损伤的肺泡毛细血管内皮细胞［24］。VEGF表达的改变在ALI肺组织的修复过程中如何影响肺泡Ⅱ型上皮细胞的增殖、修复及肺泡毛细血管膜的修补，有待于进一步研究。

    VEGF的表达受到多种因素的调控。缺氧是迄今为止所发现的最强的调节因素，缺氧引起VEGF表达增加可能与低氧可诱导性因子1（hypoxia　inducible　factor1，HIF1）的形成从而促进VEGF转录有关。

    VEGF的表达同时还受到一些生长因子的调控，如表皮生长因子（EGF）、肿瘤坏死因子α（TNFα）、TGFβ1和IL1等，这些因子在体内实验中能促进血管发生，可能是由于这些因子能促进VEGF的分泌，从而间接地促进血管发生过程［25］。

    人类VEGF基因位于染色体6p21.3，长约14 kb，含8个外显子和7个内显子。Watson等人用聚合酶链反应单链多态性(PCRSSCP) 方法首次发现VEGF基因5′转录区存在634G/C多态性，同时发现634G/C基因型与脂多糖(LPS)刺激的外周血单核细胞VEGF的分泌明显相关。其中，GG基因型携带者VEGF产量最高，GC基因型次之，CC基因型的产量最低。此外还发现VEGF基因5′转录区存在+936C/T多态性,但+ 936C/T基因型与LPS刺激的外周血单核细胞VEGF分泌无相关性。同时证明VEGF启动子上游区有+ 936C比没有该基因的转录活性大71%［26］。

    4  转化生长因子β1（TGFβ1）

    有研究报道在ARDS的致死原因中难以控制的肺纤维化约占40%～70%，而在参与肺损伤纤维化的细胞因子网络中，转化生长因子β1（TGFβ1）是最重要的细胞因子［27］。

    ARDS的肺纤维化是肺部炎症导致肺泡持续性损伤及细胞外基质（extracellular matrix, ECM）细胞反复破坏、修复、重建及过度沉积的过程，是机体组织遭受损伤后的过度修复反应［28］。肺纤维化的特点是ECM的过度沉积，肺中胶原蛋白合成速度大于降解速度，胶原纤维显著增多，最终导致胶原的逐渐积累［29］。

    TGFβ是已知最强的致纤维化细胞因子，在调节ECM代谢的细胞因子中，与ECM积聚关系也最密切，其中又以TGFβ1最为重要，其致纤维化机制为TGFβ在肺纤维化发生发展过程中持续上调，它可以趋化并促进成纤维细胞的增殖而刺激成纤维细胞分泌前胶原，上调基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)的表达来抑制胶原水解酶的活性，减少胶原的降解［28］。由此可以通过抑制TGFβ mRNA的表达，减少胶原沉积，使纤维化病变减轻。

    Smads是细胞质内TGFβ1的重要信号转导分子，Smads家族蛋白在将TGFβ信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用，且不同的Smad 介导不同的TGFβ家族成员的信号转导。TGFβ作为配体与其细胞膜上的受体结合，将活化的信号传递至细胞内，细胞内的Smad家族将信号进一步传递到细胞核内，激活核内转录蛋白，启动胶原蛋白mRNA的转录，合成胶原蛋白［28］。

    TGFβ1基因位于人类染色体19q13,包含6个内含子和7个外显子,它的启动子区有2个重要位点来启动转录并具有多种调节机制, 基因启动子区多态现象可引起转录异常, 从而影响疾病的产生或严重程度。Graiger等［30］研究结果显示TGFβ1不同基因型外周血TGFβ1浓度具有显著性差异。Wood等人研究证实TGFβ１基因至少存在8个单核苷酸多态性(SNP) 位点, 其中-509(C→T)位点位于TGFβ１基因上游启动子区域,是调节TGFβ１基因表达的重要位点［31］。

    随着研究的深入，对TGFβ及其信号蛋白的调控可能是今后ARDS治疗新的有效靶点［27］。

    此外，还有一些基因与ARDS相关，如降钙素基因相关肽（CGRP）,铁蛋白基因等。Nagase等［32］通过制作急性肺损伤模型来比较缺失CGRP的大鼠与携带CGRP大鼠的肺水肿及呼吸衰竭程度，从而推断出降钙素基因相关肽与ARDS的发生相关，携带CGRP的大鼠肺损伤程度比较重。Lagan等［33］研究发现内源性铁蛋白基因的多态性与ARDS的遗传易感性有关，编码铁蛋白轻链基因的多态性与ARDS的发生紧密相关， -3381GG基因型ARDS的患病率较高。

    综上所述，ARDS的发生发展伴随着多个基因的特异性表达，研究这些特异性表达基因对于阐明ARDS的发病及治疗的分子机制具有重要意义，并且为临床防治提供了新的思路。现已发现了许多这方面的基因，但是否还存在其他一些未知重要相关基因，以及这些基因的种类和功能如何，还有待于进一步研究。

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（收稿日期：20090312）

作者单位：滨州医学院病理生理学教研室 滨州市 256603