虾青素对ECV304细胞的抗氧化作用及其作用机制

【摘要】  目的 研究虾青素的抗氧化作用并探讨其作用机制。方法 MTT、LDH释放实验检测了虾青素对ECV304细胞活力的影响，超氧化物歧化酶（SOD）、二氨基二苯甲烷（MDA）、细胞内氧化应激活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）的测量实验检测了虾青素对ECV304细胞的抗氧化作用，ATP、细胞色素C氧化酶（COX）、线粒体跨膜电位的测量实验检测了虾青素对ECV304细胞线粒体的保护作用。结果 虾青素能保护细胞膜不受损伤，提高细胞活力，降低ROS、MDA的含量，升高SOD活性和NO含量。同时，虾青素还能显著升高ATP水平和COX活性，线粒体跨膜电位有所升高。结论 虾青素的抗氧化作用可能是通过保护线粒体功能实现的。

【关键词】  虾青素；抗氧化作用；线粒体跨膜电位；ATP

Antioxidative action of astaxanthin in ECV304 cells and its mechanism

    SONG Xiaodong  LIU Wenbo  ZHANG Lixia  et al

    Experimental Center of Binzhou Medical University,Yantai  264003

    【Abstract】  Objective  To study astaxanthin  antioxidative action in ECV304 cells and its mechanism. Methods  The effects of astaxanthin on cell viability were assayed by MTT and LDH release methods. The effects of astaxanthin on antioxidative action were examined by SOD activity and the contents of MDA,ROS and NO. The protective effects on mitochondria were checked by ATP level, COX activity and mitochondrial membrane potential.Results  Astaxanthin could protect cell membrane, increase cell viability, SOD activity, NO content,ATP level, COX activity and mitochondrial membrane potential.Meanwhile Astaxanthin decreased the contents of ROS and MDA.Conclusion  The effects of astaxanthin on antioxidative action might be completed through the pathway to protect the mitochondria.

    【Key words】  astaxanthin，antioxidative action，mitochondrial membrane potential，ATP

    正常情况下，机体的自由基处于不断产生与清除的动态平衡之中，是机体有效的防御系统。但自由基如果产生过多或清除过慢，它可以通过攻击生命大分子物质及各种细胞器，造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病，其中包括常见的肿瘤、动脉硬化、中风、心脏病、白内障、糖尿病等［1～6］，因此寻找清除自由基和抗氧化的药物是非常重要的。

    虾青素(astaxanthin)是唯一能通过血脑屏障的酮式类胡萝卜素，在其分子中，有很长的共轭双键、羟基和在共轭双键链末端的不饱和的酮基，其中羟基和酮基又构成α羟基酮，这些结构都具有比较活泼的电子效应，能向自由基提供电子，使得虾青素具有抗氧化作用。本实验通过虾青素对H2O2氧化损伤人血管内皮细胞ECV304的保护作用，初步研究了虾青素的抗氧化作用及其作用机制。

    1  材料与方法

    1.1  仪器和试剂  虾青素、DMEM粉剂、MTT购自Sigma公司， LDH、 MDA、SOD测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，NO、ROS、ATP、线粒体分离试剂盒、线粒体跨膜电位测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所，荧光分光光度计购自美国埃尔默公司，酶标仪购自上海雷勃分析仪器有限公司，流式细胞仪购自美国贝克曼公司。

    1.2  细胞培养  人血管内皮细胞ECV304购自美国ATCC，细胞接种于培养瓶内，加入含10％胎牛血清、青霉素、链霉素的DMEM细胞培养液，每2～3 d更换1次培养液，待培养形成的细胞汇合成单层细胞以后，用0.25％胰蛋白酶消化传代或接种于培养板上，保持细胞状态良好以备实验使用。

    1.3  ECV304细胞分组处理  将ECV304细胞分为对照组、模型组、高/中/低不同剂量药物组。对照组和模型组使用正常培养液进行培养,高、中、低不同剂量药物组分别用含0.2、2.0和20 μg/L 的虾青素培养液培养,48 h 后除对照组外均用100 μmol/L 的H2O2进行处理8 min ,离心去掉上清液备用。

    1.4  MTT检测  将ECV304细胞接种于96孔板，药物处理后每孔加15 μl染料溶液MTT，放入37℃、5%CO2培养箱中培养4 h，吸弃上述溶液后，加100 μl异丙醇终止液，室温30 min，酶标仪上570 nm处测定OD值。

    1.5  乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）释放检测  收集24孔板中处理后的细胞和细胞培养液，按照LDH试剂盒说明，分别测定细胞和细胞培养液A值，按照公式计算乳酸脱氢酶活力，LDH释放百分比=（测定管A值-测定空白管A值）× α ×1 000 ml/样品取样量（ml）×测试前样品稀释倍数，α为标准曲线斜率倒数，此处为0.380。

    1.6  超氧化物歧化酶（SOD）活性检测  到预定时间，收集6孔板上的ECV304细胞，550 nm波长处分别测定细胞内和细胞培养液的OD值，根据公式计算：每ml反应液中SOD抑制率达50%时，所对应的SOD量为一个亚硝酸盐单位（NU），SOD活力NU/ml=（对照管吸光度-测定管吸光度）×稀释倍数/对照管吸光度×2。

    1.7  ROS 测定  到预定时间，收集96孔板上的ECV304细胞，加入5 μmol /L 二氯荧光素(DCF) 预处理细胞30 min。荧光分光光度计（激发光484 nm，发射光为5 301 nm）检测各组细胞的荧光强度。

    1.8  丙二醛(MDA)测定  到预定时间，收集24孔板上的ECV304细胞，按试剂盒操作说明书进行，用722型分光光度计于532 nm波长测定其吸光度值，计算各组MDA含量。

    1.9  NO测定  细胞收集后，加入5 μmol/L的DAFFM DA (NO荧光探针)100 μl重悬细胞。37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。每隔3～5 min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。PBS洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DAFFM DA。适量PBS混悬细胞，室温下荧光分光光度计检测（激发波长495 nm，发射波长515 nm）。

    1.10  ATP测定  CelltiterGloTM 试剂盒A液和B液混合，室温下静置1 h。向96孔板的各孔处理细胞中每孔加入100 μl CelltiterGloTM混合液，5 min后酶标仪检测（波长562 nm）。

    1.11  线粒体细胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase, COX)活性的测定  按照线粒体分离试剂盒说明抽提待测细胞线粒体后，加入含有蛋白抑制剂的线粒体裂液裂解线粒体,用BCA 法测定蛋白浓度。制作标准曲线,计算每个线粒体样品的蛋白浓度。线粒体细胞色素C氧化酶能将还原型的细胞色素C(在550 nm 波长高吸收峰)转化为氧化型细胞色素C(在550 nm 波长低吸收峰)。根据这个原理,向含有还原型细胞色素C的反应体系中加入线粒体样品, 加入样品后0 s与60 s分别用分光光度计比色测OD值, 0 s 与60 s差值反映细胞色素C 氧化酶的活性。根据前述测得的线粒体蛋白浓度将细胞色素C氧化酶活性的单位转化为μmol/(min·mg pro)。

    1.12  线粒体跨膜电位检测  将待测细胞1 000 r/min离心收集，PBS清洗2次，加入1ml的终浓度为1 μg/ml 的Rhodamine123，放入37°C孵箱里静置培养45 min。PBS清洗2次，倾去原有液体。250 μl PBS重悬，缓慢加入-20℃乙醇750 μl，流式细胞仪检测（激发波长488 nm，发射波长525 nm）。

    1.13  统计方法  实验数据均采用x±s表示,应用SPSS 11. 5 for windows统计软件进行单因素方差分析,P＜0.05为有统计学意义。

    2  结果

    2.1  虾青素对ECV304细胞活力的影响  3 种不同浓度虾青素对H2O2 处理的ECV304细胞活力的影响，MTT结果可看出（表1）,虾青素组和对照组的细胞活力较模型组有显著增加 , 且虾青素组处理的细胞活性随剂量升高而增强。LDH释放测定结果显示（表1），H2O2 处理的ECV304细胞膜受到严重损害，虾青素对细胞膜有保护作用，其保护作用随虾青素剂量升高而增强。表1  不同浓度虾青素对H2O2 处理的ECV304细胞活力影响注：*P＜0.05，△P＜0.01

    2.2  虾青素对ECV304细胞的抗氧化作用  从3种不同浓度虾青素对H2O2 处理的ECV304细胞的抗氧化作用结果看（表2），虾青素组的SOD 活性、NO含量和模型组比较较模型组增强，而虾青素组的ROS、MDA的含量和模型组比较较模型组显著降低，并且SOD 活性、ROS、MDA、NO的含量与虾青素呈现一定量效关系。表2  不同浓度虾青素对细胞SOD、ROS、MDA的影响

    2.3  虾青素对ECV304细胞线粒体的保护作用  3种不同浓度虾青素能显著升高H2O2损伤后ECV304细胞的ATP水平、细胞色素C氧化酶活性，与模型组比较差异有统计学意义，并且各组数值与虾青素呈现一定量效关系（表3）。细胞荧光分析图（图1）纵轴表示细胞数量，横轴表示荧光强度，主峰右移表示荧光强度增强，线粒体跨膜电位升高。荧光强度越大，表示线粒体跨膜电位越高；反之则低。从线粒体跨膜电位检测结果看虾青素能升高线粒体跨膜电位，并呈现一定量效关系。表3  不同浓度虾青素对ATP、细胞色素C氧化酶活性的影响

    3  讨论

    虾青素是一种链断裂型抗氧化剂，作为抗氧化剂虾青素比其他类胡萝卜素有明显的优势。Hix等［7］首先提出在高压氧的条件下，β胡萝卜素可以加强氧化剂的氧化性，而虾青素的抗氧化能力被证明比β胡萝卜素强。Lee等［8］比较了共轭双键数不同的叶黄素、玉米黄质、番茄红素、异玉米黄素和虾青素5种类胡萝卜素及其衍生物在豆油光氧化作用中淬灭活性氧的作用，以虾青素作用最强。本实验结果显示虾青素能提升H2O2处理过的ECV304细胞活力，增强细胞的抗氧化能力，对线粒体有显著的保护作用。

    虾青素在增强细胞活力方面，Liu等［9］曾报道虾青素能通过提升DHA H2O2处理后的SHSY5Y 细胞活力,起到保护神经细胞的作用。O′Connor 等［10］报道虾青素能防止紫外线对细胞膜的损害。本实验 MTT结果显示受过H2O2处理的细胞其活力与对照组相比明显降低，并且LDH释放实验也显示H2O2处理的细胞其细胞膜结构的完整性受到破坏，但是经过虾青素预处理的细胞其细胞活力有所提升，细胞膜受损的程度显著降低，说明虾青素能够保护细胞免受外界损害。

    虾青素之所以有保护细胞的作用，研究推测是由于它具有极强的抗氧化功能。Fassett等［11］报道在肾移植病人的饮食中增加虾青素能降低病人动脉的氧化应激，从而减少动脉粥样硬化并发症的发生。本实验检测了虾青素体内外的抗氧化作用，体外实验结果显示虾青素能抑制ROS的生成，减少自由基的产生，同时提高SOD的活性，增强细胞清除自由基的能力，最终实现减轻自由基对细胞的伤害。此外实验结果还显示虾青素能升高内皮源性舒张因子NO的浓度，降低膜脂过氧化产物MDA的含量。

    线粒体的主要作用是氧化产能，以建立离子梯度和合成ATP，有研究推测虾青素的抗氧化作用机制与其保护线粒体的作用是密不可分的。Manabe等［12］报道虾青素驻留于线粒体从而抑制了线粒体产生ROS达到抗氧化的作用。本实验结果也显示虾青素对线粒体的功能有保护作用，虾青素处理过的细胞线粒体ATP水平升高，细胞色素C氧化酶活性增强，跨膜电位有所升高。

    本文全面系统的研究了虾青素的体内外抗氧化作用，并初步探讨了抗氧化作用的机制，为虾青素的临床应用提供了科学的实验数据。

【参考文献】
  ［1］ Gao M, Yeh PY, Lu YS. OSU03012, a novel celecoxib derivative, induces reactive oxygen speciesrelated autophagy in hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Res，2008，68(22):93489357.

［2］ Ali ZA, Bursill CA, Douglas G. CCR2mediated antiinflammatory effects of endothelial tetrahydrobiopterin inhibit vascular injuryinduced accelerated atherosclerosis［J］.Circulation，2008，118(14):S7177.

［3］ Vassalle C, Pratali L, Boni C. An oxidative stress score as a combined measure of the prooxidant and antioxidant counterparts in patients with coronary artery disease［J］.Clin Biochem，2008，41(15):11621167.

［4］ Yagi K, Kitazato KT, Uno M. Edaravone, a Free Radical Scavenger, Inhibits MMP9Related Brain Hemorrhage in Rats Treated With Tissue Plasminogen Activator［J］.Stroke，2009，40（2）：626631.

［5］ Kamat CD, Gadal S, Mhatre M.Antioxidants in central nervous system diseases: preclinical promise and translational challenges［J］.J Alzheimers Dis，2008，15(3):473493.

［6］ Piecha G, Koleganova N, Gross ML.Oxidative stress after uninephrectomy alters heart morphology in the apolipoprotein E -/- mouse［J］.J Hypertens，2008，26(11):22202229.

［7］ Hix LM, Lockwood SF, Bertram JS. Bioactive carotenoids: potent antioxidants and regulators of gene expression［J］.Redox Rep，2004，9(4):181191.

［8］ Lee SH, Min DB. Effects of quenching mechanism and kinetics of carotenoids in chlorophyllsensitized photooxidation of soybean oil［J］.J Agric Food Chem, 1990, 38(8):1630.

［9］Liu X, Shibata T, Hisaka S. Astaxanthin inhibits reactive oxygen speciesmediated cellular toxicity in dopaminergic SHSY5Y cells via mitochondriatargeted protective mechanism［J］.Brain Res，2008，1248:141148.

［10］ O'Connor I, O'Brien N. Modulation of UVA lightinduced oxidative stress by betacarotene, lutein and astaxanthin in cultured fibroblasts［J］.J Dermatol Sci，1998，16(3):226230.

［11］ Fassett RG, Healy H, Driver R. Astaxanthin vs placebo on arterial stiffness, oxidative stress and inflammation in renal transplant patients (Xanthin): a randomised controlled trial［J］.BMC Nephrol. 2008，9(1):17.

［12］Manabe E, Handa O, Naito Y. Astaxanthin protects mesangial cells from hyperglycemiainduced oxidative signaling［J］.J Cell Biochem. 2008，103(6):19251937.

作者单位：滨州医学院实验中心 烟台市 264003