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【摘要】 目的 探讨哮喘大鼠淋巴液中淋巴细胞线粒体跨膜电位、Fas/FasL变化以及地塞米松干预的影响。方法 建立哮喘模型，收集激发后2、6、12、24、48 h淋巴液、血液、肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中淋巴细胞，流式细胞仪(FCM)检测淋巴细胞线粒体的跨膜电位(△·ψm)，细胞免疫组化(SABC法)检测淋巴细胞表面Fas/FasL蛋白的表达。结果哮喘组淋巴液、血液、BALF淋巴细胞线粒体跨膜电位均较对照组和治疗组峰值升高(P<0.05)，而对照组和治疗组之间则无显著性差异(P>0.05);与对照组、治疗组相比较，哮喘组淋巴液和BALF中淋巴细胞表面Fas、FasL蛋白光密度明显降低(P<0.001)，而治疗组和对照组比较无显著性差异(P>0.05)。结论 哮喘大鼠淋巴液、血液、BALF中均存在明显的淋巴细胞早期凋亡障碍和Fas/FasL表达降低，尤其是哮喘淋巴液中淋巴细胞凋亡障碍和Fas/FasL降低程度较其血液、BALF更为明显;地塞米松可能是通过提高哮喘Fas/FasL蛋白的表达来加速淋巴细胞凋亡而发挥治疗作用。
【关键词】 哮喘;淋巴液;线粒体跨膜电位(△·ψm);Fas/FasL;凋亡
Lymphocyte mitochondrial membrane potential in the lymph of bronchial asthmaticrat and the effect of dexamethasone on it
XING Chaopin1 FENG Xuebin1 SONG Xiaodong2 et al
1 Depertment of Pediatric,Binzhou Medical University,Binzhou 256603;2 Experimental Conter of Binzhou Medical University
【Abstract】 Objective To observe the levels of lymphocyte mitochondrial membrane potential(△·ψm) and Fas/FasL change in lymph,and the effect of dexamethasone on it.Methods The establishment of asthma model .After the inspired collection 2 h,6 h,12 h,24 h,48 h lymph, blood, bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of lymphocytes by flow cytometry (FCM) detection of lymphocyte mitochondria transmembrane potential (△·ψm), cell immunohistochemistry (SABC method) was used to detect cell surface Fas FasL protein expression.Results The peak of mitochondrial transmembrane potential in the asthma lymph, blood, BALF lymphocytes was lower compared with the control group and treatment group (P<0.001). There was no significant difference between the control and treatment groups (P>0.05).The Fas, FasL protein optical density on the surface of lymphocytes in the asthma lymph,BALF was obvious lower than that of the control and treatment group, and there was no significant difference between the control group and treatment group.Conclusion The early lymphocyte apoptosis obstacles and the low of Fas / FasL expression were found in asthma rat in lymph,blood and BALF. Particularly, the degree of T lymphocyte apoptosis obstacles and low of Fas / FasL in lymph were remarkable to the blood and BALF in asthma. Dexamethasone may enhance the cell surface through the Fas / FasL expression to accelerate the apoptosis of lymphocytes in asthma.
【Key words】 asthma, lymph,mitochondrial membrane potential，Fas/FasL，apoptosis
支气管哮喘(简称哮喘) 是临床常见的慢性呼吸道疾病,其发病机制尚未明确[1]。诸多研究认为T细胞增多是哮喘炎症持续存在的关键环节[2]。关于哮喘时T细胞增多的机制研究目前大多集中于外周血、肺泡灌洗液(BALF)等组织，而关于哮喘淋巴液免疫状态研究尚未见报道。本文通过检测哮喘大鼠淋巴液中淋巴细胞线粒体跨膜电位、Fas/FasL变化，并观察地塞米松干预的影响，探讨淋巴液中淋巴细胞凋亡与哮喘之间的内在关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物：清洁级SD大鼠90只(山东绿叶制药厂动物中心)，雌雄各半，体重在200～220 g，月龄2～3个月。随机分为对照组(30只)、哮喘组(30只)，治疗组(30只)。
1.1.2 主要试剂和仪器：卵白蛋白(OVA, GradeV、II，美国Sigma公司)。RH123(美国Sigma公司)，淋巴细胞分离液(中国科学院天津试剂厂)，兔抗鼠Fas、FasL检测试剂盒(武汉博士德生物有限公司)，SABC试剂盒(武汉博士德生物有限公司)，JSCOK型单双通用水电分离式超声波雾化器(辽宁省鞍山市电子医疗仪器厂)，EPICS XL流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)，IMAGEPRO PLUS图像分析系统( 美国Media Cybernetics公司)。
1.2 方法
1.2.1 大鼠哮喘模型的建立:参照文献[3]的方法。实验组大鼠分别于实验第1天、第8天用新鲜配制的OVA( GradeV) 1 mg + 氢氧化铝200 mg + 生理盐水1 ml 混悬液在大鼠两腹股沟、腹部、前足跖4 个部位做皮下注射(每点0.2 ml),同时腹腔注射0.2 ml。于第15天,将大鼠置于20 cm×20 cm×15 cm大小的密闭容器中,用1%OVA 进行雾化吸入激发,每次雾化30 min ,连续7 d。对照组大鼠以等量的生理盐水代替卵白蛋白，同法、同量、同期进行致敏和激发，治疗组雾化吸入前30 min给予地塞米松2 mg/kg(生理盐水稀释为0.4 mg/ml)，每只每天腹腔注射。对照组、哮喘组、治疗组大鼠分别于激发后2、6、12、24、48 h 收集取淋巴液、BALF和血液分离淋巴细胞进行检测。
1.2.2 大鼠淋巴液的采集：大鼠仰卧位，4%水合氯醛0.1 ml/kg腹腔注射麻醉，常规消毒。于剑突耻骨联合连线上2/3作腹部正中切口，将肠内容物移出腹腔，用温盐水纱布包裹。在右肾动脉水平，肠系膜上动脉处寻找肠系膜淋巴干。用留置针插入淋巴管，收集0.5 ml淋巴液。常规分离淋巴液中淋巴细胞，调整细胞浓度为1×106/ml。
1.2.3 大鼠BALF、血液的收集：打开胸腔，充分暴露颈部,分离气管, 0号丝线结扎右主支气管。切开气管，行气管插管，固定，经气管行左肺支气管肺泡灌洗。用5 ml冷生理盐水分3次注入，约30 s后回收BALF，回收率高于80%。收集4 ml左右灌洗液4℃ 1 000 r/min，离心10 min，将沉淀细胞用1 ml PBS悬浮后，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，调整细胞浓度为1×106/ml。心脏穿刺取血，收集4 ml左右置于肝素离心管内，常规分离液分离淋巴细胞，调整细胞浓度为1×106/ml。
1.2.4 流式细胞仪检测淋巴细胞线粒体跨膜电位：分离的淋巴细胞用PBS清洗2次,加入1ml的终浓度为1 μg/ml Rhodamine123放入37 ℃孵箱里静置培养45 min;PBS清洗2次,倾去原有液体;250 μl PBS重悬,缓慢加入-20 ℃乙醇750 μl;流式细胞仪检测(激发波长488 nm，发射波长525 nm)。
1.2.5 免疫组化检测淋巴细胞表面Fas、FasL表达：分离的淋巴细胞滴加在防脱片载玻片上，晾干后放入4%多聚甲醛中浸泡,室温下固定2 h,蒸馏水洗涤2 min×2次,室温下凉干即成标本片;标本片放入-20℃冰箱存放待用。按照试剂盒说明书操作，阴性对照用PBS代替一抗，余步骤相同。封片后每张切片选择5个不同视野采用IMAGEPRO PLUS图像分析系统进行定量分析，结果以光密度值表示。
1.2.6 肺组织标本留取及组织形态学观察：取未经支气管灌洗的大鼠肺脏，观察肺脏大体病理改变。左肺上叶注入4%多聚甲醛5 ml,取下置于4%多聚甲醛中固定1周。取固定的肺组织常规石蜡包埋、切片，常规HE 染色;普通光学显微镜下观察肺脏组织形态结构。
1.3 统计分析 实验数据以x±s表示，应用SPSS13.0统计学软件进行分析，用F检验进行两样本方差齐性检验，重复测量资料用方差分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用q检验。显著性水准α=0.05。
2 结果
2.1 哮喘组大鼠临床症状及组织病理学观察 哮喘组大鼠在卵白蛋白激发过程中，表现出蜷伏不动，呼吸急促，口唇爪有不同程度紫绀，张口呼吸，大小便失禁，连续激发后毛色失去光泽，烦躁不安。刺激数天后部分大鼠症状逐渐加重。对照组大鼠无上述变化，治疗组变化明显减轻。
光镜下哮喘肺组织支气管黏膜增厚,大量炎性细胞浸润,管腔狭窄,肺泡上皮细胞破坏，对照组大鼠支气管壁光滑、完整,支气管、血管周围未见炎性细胞浸润。治疗组变化较哮喘组明显减轻。
2.2 淋巴液、血液、BALF中的淋巴细胞△·ψm水平比较 哮喘组大鼠在2、6、12、24、48 h各时间点淋巴液中的淋巴细胞△·ψm峰值较对照组和治疗组明显升高(P<0.001);血液中的淋巴细胞△·ψm峰值均较对照组和治疗组明显升高(P<0.05);BALF中的淋巴细胞△·ψm峰值均较对照组和治疗组明显升高(P<0.01);治疗组各时间点淋巴液、血液和BALF中淋巴细胞△·ψm峰值与对照组均无显著性差异(P>0.05)，详见表1。表1 淋巴液、血液、BALF中的淋巴细胞△·ψm水平比较
2.3 淋巴液、血液、BALF中淋巴细胞Fas蛋白表达比较 哮喘组大鼠在2、6、12、24、48 h 各时间点淋巴液中淋巴细胞表面Fas蛋白表达均较对照组和治疗组明显降低(P<0.001), 血液中的淋巴细胞表面Fas蛋白表达均较对照组和治疗组明显降低(P<0.05)，BALF中的淋巴细胞表面Fas蛋白表达均较对照组和治疗组明显降低(P<0.01)，治疗组各时间点淋巴液、血液和BALF中淋巴细胞表面Fas蛋白表达水平与对照组均无显著性差异(P>0.05)，详见表2。表2 淋巴液、血液、BALF中淋巴细胞表面Fas蛋白表达比较 注：*与对照组相比P<0.001， △与对照组相比P<0.01，#与对照组相比P<0.05
2.4 淋巴液、血液、BALF中淋巴细胞FasL蛋白表达比较 哮喘组大鼠在2、6、12、24、48 h 各时间点淋巴液中淋巴细胞表面FasL蛋白表达均较对照组和治疗组明显降低(P<0.001), 血液中的淋巴细胞表面Fas蛋白表达均较对照组和治疗组明显降低(P<0.01)，BALF中的淋巴细胞表面Fas蛋白表达均较对照组和治疗组明显降低(P<0.01)，治疗组各时间点淋巴液、血液和BALF中淋巴细胞表面FasL蛋白表达水平与对照组相比均无显著性差异(P>0.05)，详见表3。
3 讨论
哮喘是由多种因素引起的以可逆性气道阻塞、气道高反应性和气道炎症为特征的变态反应性疾病，其中气道炎症是最显著的病理变化,并决定着气表3 淋巴液、血液、BALF中淋巴细胞表面FasL蛋白表达比较 注：*与对照组相比P<0.001，△与对照组相比P<0.01
道阻塞和气道高反应性的程度[1]。目前研究表明T淋巴细胞凋亡障碍是导致哮喘气道炎症持续存在的重要因素之一[2]。淋巴液是富含淋巴细胞及其细胞因子、蛋白质和脂质的体液，淋巴液回流不仅对血容量的恢复起到代偿作用,而且还有利于发挥免疫系统对病原微生物的监视及免疫应答作用[4]。迄今有关哮喘时T细胞凋亡的研究主要集中于外周血、BALF以及体外实验等方面，对于哮喘淋巴液中淋巴细胞凋亡及其Fas/FasL系统的变化特点及其规律研究尚未见报道。
细胞凋亡(apoptosis)是维持机体生长发育、内环境稳定以及免疫调节的重要机制。线粒体是细胞进行电子传递、三羧酸循环和氧化磷酸化反应、产生能量的重要场所,同时线粒体也是程序化死亡信号转导途径中起关键调节作用的细胞器。在细胞凋亡中，无论是依赖caspases的程序化死亡途径,还是非依赖caspases活性的细胞死亡机制都与线粒体有关[5]。业已发现在细胞凋亡早期线粒体内膜通透性增大,线粒体内膜跨膜电位(△·ψm)下降,能量合成水平显著降低。通过抑制线粒体的三羧酸循环或呼吸链功能即可引起细胞凋亡，在细胞核出现凋亡性改变之前,常常先有线粒体跨膜电位的降低。体内外实验证明阻止线粒体通透性的改变可防止细胞凋亡[8]。因此，线粒体跨膜电位(△·ψm)下降是反映早期细胞凋亡的敏感指标之一。本研究结果表明哮喘组淋巴液、血液和BALF中淋巴细胞△·ψm峰值在各时间点均较对照组明显升高;哮喘组淋巴液中淋巴细胞△·ψm在不同时间点均较血液水平明显升高，而其血液中淋巴细胞△·ψm与BALF水平间无显著性差异;地塞米松干预后哮喘组淋巴液中淋巴细胞线粒体跨膜电位较其血液、BALF明显降低。提示哮喘时淋巴液、血液、BALF中均存在明显的淋巴细胞早期凋亡障碍，其中以淋巴液中淋巴细胞凋亡障碍最为明显，且发生时间要早于血液和BALF。表明淋巴液是哮喘发生淋巴细胞凋亡障碍最早、最明显的场所。
Fas/FasL 是介导细胞凋亡的主要形式[9]。近年报道，Fas/FasL异常在急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)等肺部炎症的发生发展中发挥重要作用。Tong等研究发现T细胞Fas表达缺陷是导致哮喘炎症的持续存在和产生一系列的哮喘症状(如黏液栓形成、气道高反应性等)的重要因素之一[10]。本研究表明哮喘组淋巴液、血液、BALF中淋巴细胞Fas、FasL蛋白表达水平在各时间点均显著低于对照组水平;哮喘组大鼠淋巴液中淋巴细胞Fas、FasL表达水平在各时间点均低于血液、BALF水平，而BALF与血液间无显著性差异。哮喘组淋巴液中的淋巴细胞Fas、FasL降低水平亦明显早于其血液和BALF水平。地塞米松干预治疗组淋巴液中淋巴细胞表面Fas、FasL蛋白表达水平较其血液、BALF明显升高。提示哮喘淋巴液、血液和BALF中均存在Fas/FasL表达障碍，而且淋巴液中Fas/FasL表达障碍最为显著。哮喘淋巴细胞凋亡障碍可能与Fas、FasL表达减少有关，而地塞米松可能通过增强淋巴细胞表面的Fas/FasL表达促进淋巴细胞凋亡。
【参考文献】
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作者单位：1 滨州医学院儿科学教研室 滨州市 256603;2 滨州医学院医学实验中心