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Advance in the research of phosphoglycerate kinase WU De, WU Zhong-dao, YU Xin-bing (Department of Pathogenic Biology of Zhongshan University Medical College, Guangzhou 510089, Guangdong, P R China)
磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase PGK)是糖酵解的关键酶，也是每种生物得以生存的必须酶，该酶的缺乏可引起生物体代谢等功能的紊乱。PGK是一个单体的、高度柔曲性的糖酵解酶，它主要由两个球形的结构阈构成，在与底物结合的过程中发生显著的构相改变，最终发生催化效应。该酶在一些细菌细胞中只有一种，而在大多数生物体内则含2～3种同工酶，这些同工酶除在生物体内的分布不一样外，还表现出独特的生物学功能。PGK存在于所有的有机生命中，在整个进化过程中，它的序列是高度保守的。人们根据这一保守特点，罗列出9个PGK蛋白质指纹，从而为未知的PGK序列提供生物信息学的鉴定依据。本文主要从PGK的基因结构，蛋白质的结构和功能以及人们如何通过PGK进化树和指纹等方法来鉴定物种和未知序列这几个方面进行综述。
1 磷酸甘油酸激酶的功能
糖酵解是PGK的主要功能，在糖酵解第二个阶段的第二步，它催化1，3-二磷酸甘油酸(1，3-diphosphoglycerate)转变成3-磷酸甘油酸(3-phosphoglycerate 3-PG)，在这过程中消耗一分子的ADP，产生一分子的ATP［1～3］。如果逆反应发生，则形成一个分子的ADP(图1)。在大多数细胞，这种反应是非常必要的，如在需氧菌中ATP的产生，在厌氧菌中的发酵以及在植物中碳的固定等［1］。一旦PGK基因突变而失去功能或功能减弱将会给生命体带来严重威胁。到目前为止，人的PGK基因共报道有13不同的突变体发生［4］，PGK基因发生突变的人可导致许多不同的临床症状，最常见的是慢性贫血(如溶血性贫血)，同时可伴有智力减退、神经功能的紊乱和肌肉病(如横纹肌溶解)等［3］。PGK可被硫酸盐离子激活，当硫酸盐离子浓度大约为50mM时，这种激活影响最大［4］。图1 PGK在糖酵解中的化学反应 最近的研究表明，PGK除糖酵解功能外，还有一个新的细胞外功能，即在肿瘤血管生成过程中起二硫化物还原酶的作用。肿瘤细胞缺氧时，它能利用糖酵解的酶包括PGK产生ATP。被肿瘤分泌的PGK在血浆中可促进二硫键的裂解，这就触发血管生成抑制因子—血管他丁的释放。在长有纤维瘤的实验鼠身上，血浆PGK水平提高；给实验鼠施用PGK，会提高血浆血管他丁的水平，抑制肿瘤生长［5］。
2 磷酸甘油酸激酶的蛋白质结构
PGK作为单体形式存于生物体当中，它含有两个几乎大小相等的，各占整个蛋白质结构一半的结构域，它们分别对应于N端和C端，其中C端的最后15个氨基酸残基回转插入N端结构域。从结构上来看，PGK由N端和C端结构域组成，N端和C端结构域由一个狭窄的铰链区连接着，而且被一个大的裂隙分开(如图1)。3-磷酸甘油酸结合到N端，而核苷底物MgATP或MgADP则结合到这个酶的C端结构域。这两个超大结构域的结构也与铰链弯曲所带来的大范围构象改变有关，这和已糖激酶的构象非常相似。每个结构域的核心是有被α螺旋包绕的6股平行折叠的β片层构成。结构域1有一个顺序为342156的6股平行的β片层，而结构域2则有一个顺序为321456的6股平行的β片层。对酵母PGK进行可逆转的展开分析发现，这两个球形结构可独立地进行折叠，这种折叠与折叠过程中存在的介质有关，并且与单一结构域的折叠一致［6］。
PGK是一个高度柔曲性的糖酵解酶，在与底物结合过程中发生显著性的构相改变，这一点在布氏锥虫的PGK三重复合体中得到证明［7］。在锥虫的血流期，糖酵解是它的唯一的能量来源，所以这个酶是一个有重要价值的、具有潜在的药物设计靶标［8］。PGK的催化作用是选择性的，一旦底物已经结合，只有这些活性位点的各个成份被正确的定位，这种催化作用才会发生。理解这种构象的改变是铰链区，铰链区是由两条连接两端结构域的多肽链的关口组成。第一个关口是由螺旋7形成，含有从195到210的氨基酸残基。它含有两个截然不同的铰链转动点，分别位于铰链弯曲的N和C侧。第二个多肽关口是由螺旋14形成，一个由从397到404的氨基酸残基构成的关键催化作用成分。这个螺旋通过转换铰链的关闭来呈现酶的催化构象。N端铰链转动点由残基195到197构成，这几个残基位于N端螺旋7适合N端结构域移动的N端铰链区。C端铰链转动点含有C端螺旋7的大约从204到207的氨基酸残基，它主要参与C端的运动。而螺旋13也是构成催化位点区的一个重要组成部分［9］。
到目前为止，猪、马和酵母的PGK晶体结构已经搞清楚。酵母PGK晶体结构显示，它也是一种单体酶(Mr 45 000)，由两个球形结构域组成。每个结构域几乎与平分多肽链的N端和C端相对应。C末端扩展延伸到结构域内的铰链区而且可包绕了N端的结构域。这种结构域的运动最终导致了左翼活性位点的关闭，这对PGK的催化是非常必要的。有人推测是由硫酸盐离子导致了酶的大范围的构象改变，最终导致了酶的活化。为了检测C端在底物和硫酸盐诱导的构象改变中所起的作用，使用直接点突变法，即移走C末端的15个氨基酸残基，研究发现：突变后的酶只有天然酶活性的1%，而且失去了被硫酸盐诱导活化的能力，ATP的Km基本上没有改变(Km=023mM)，而3-PG的Km值增加了近8倍(突变前和突变后各自的Km值分别是385mM和050mM)，这些结果表明C端在底物和特异性诱导构象改变机制中是非常重要的。CD光谱和沉降速度测量分析表明，C端肽段在保持PGK的完整性方面是必不可少的。这种突变的酶对热灭活的敏感性增加，这表明C端肽段在保持PGK的稳定性方面起着举足轻重的作用［9～14］。
图2 磷酸甘油酸激酶的3D结构图 (略)
3 磷酸甘油酸激酶的基因结构及其同工酶
PGK是同工酶，在某些生物体内，它可多达三种同工酶。细菌只有一种PGK酶，其唯一的功能就是参与糖酵解。然而在哺乳类动物基因组中有两种PGK酶，其一是PGK-1，它是X连锁的，且在所有的体细胞中都有表达；其二是PGK-2基因，它位于常染色体上，而且只在精子发生细胞中表达。PGK-2基因的唯一功能是补偿由于X染色体在精母细胞中的失活所导致PGK-1的抑制表达［11］。另外，PGK-2基因是编码唯一特性的、有益于精子的同工酶。John R等人用探针检测PGK-2在小鼠中的转录时发现，PGK-2基因在精母细胞和精子细胞中都有转录，这与X连锁的PGK-1基因在人睾丸生精过程中的这个时期抑制相一致。在精子发生过程中，研究PGK-1和PGK-2同工酶的分布时也发现，PGK-2蛋白没有任何细胞内定位信号，此外，它在体外要比PGK-1稳定［11］。
人PGK1基因与X连锁，位于Xq133，含有10个内含子和11个外显子，跨度达23Kbp，该基因在所有的组织都有相应的蛋白表达［12，13］。PGK2基因位于常染色体的19p133，主要在睾丸中表达，这个基因无内含子。锥虫和短膜虫有三个PGK同工酶，分别为PGKA、PGKB和PGKC。硕大利什曼原虫有两个与锥虫和短膜虫相对应的PGKB和PGKC，而这两个基因主要不同在于C端有62个AA的差别。PGKC基因位于glycosome，而PGKB位于细胞浆，两个基因全部在前鞭毛体中表达，PGKB的转录量是PGKC的4～5倍。其中PGKC基因组片段长275kb，外显子长1440bp，编码480个AA，分子量为515Kda，C端有62AA延伸，基因B的基因组全长3kb，外显子长1314bp，编码417个AA，分子量为449Kda。布氏锥虫，刚果锥虫和短膜虫都有PGKA，该基因大小56Kda，与其他两个相比，氨基端有大片段的插入，活性位点是高度保守的，基因B编码胞浆蛋白(45Kda)，位于PGKA的下游，主要在生活史的昆虫期表达，而短膜虫基因B则编码435Kda，基因C位于B基因的下游。在布氏锥虫C端有20个AA，在短膜虫则有48个AA，这两个延伸都是进入gly cosome的转位信号［14～17］。
4 甘油酸激酶的进化研究
PGK存在于所有的有机生命中，在整个进化过程中，它的序列是高度保守的，那么通过PGK序列绘制进化树成为可能。进化树可以初步对某一物种进行鉴定，还可通过进化距离判断两个物种的亲缘关系。Colgan利用39种41个有袋类动物的PGK绘制了进化树，通过进化树的分析对这些物种进行了区分，并对一些在分类上有争议的动物进行了明确的归类［18］。本文对170个PGK基因(覆盖164种生物)进行编排整理，利用clustalW软件绘制进化树。从分类来看，该进化树对这164种动物都准确地进行了分类，不足之处是在进化距离上存在一定的差异，这主要是由计算这一数据的软件所致。与利用5sRNA绘制进化树相比，单从碱基序列的获得来看，它较5sRNA更容易获得。因此，利用PGK绘制进化树是一种较为方便的，行之有效的分类方法。
5 磷酸甘油酸激酶的蛋白质指纹研究
蛋白质指纹是通过PRINTS数据库已经存在的定义某一蛋白质家族的指纹对所要查询的未知序列进行分类的一种工具，它特别适合进化关系上较远的蛋白质分类，它与同源性分析比较，其鉴定的特异性大大地提高了。而PRINTS数据库则是由一组保守的氨基酸序列基序构成，它们一起能为蛋白质家族提供诊断性鉴定。这种鉴定是通过多基序的匹配以及前后之间的序列联系，与单个基序模型的方法相比较，这种方法更有效、更强大。与其他匹配方法不同的是，蛋白质指纹适合分级鉴定，如这种方法已经被用于G蛋白偶连受体超家族的分类和受体亚型的鉴定，它还被用于许多通道蛋白的次分类以及运输蛋白和酶的功能鉴定等［19］。通过对磷酸甘油酸激酶的14个起始的氨基酸序列的分析，确定具有鉴定性的基序共有9个，分别为1)DLKGKRVLIRVDFNVPL；2)ITDDTRIRAALPTIKYLLDNGAK；3)GDVILLENVRFHKEEE；4)LGDVYVNDAFGTAHRAHASMVGV；5)AGFLMEKELDYFAKALENPERPF；6)LAILGGAKVSDKIQLIDNLL；7)TIVWNGPMGVFEFDPFAKGTKAIAKA；8)SIIGGGDTAAAA；9)VSTGGGASLELLEGKELP。它们为PGK家族的鉴定提供理论依据。这些指纹起源于：1～4基序位于N端的结构域，基序5的一部分与铰链区结构域相一致，而6～9基序位于C端结构域，其中基序7跨越底物结合的保守残基。为了更清楚展示PGK指纹在对其蛋白质家族鉴定过程中所起的作用，我们在这里选举了一未知华支睾吸虫基因的蛋白质序列，对其进行蛋白质指纹鉴定，鉴定结果如下表。
表1 华支睾吸虫PGK的指纹鉴定结果 (略)
表2 PGK指纹与华支睾吸虫PGK基序鉴定中的分析结果 (略)
注：Noof Motifs：要查询的序列中与指纹相匹配的同源性基序号码；SumID：与匹配的基序同源百分率分值；AveID：与匹配的基序同源性百分率的平均分值；PfScore：总体分值；PValue：由总体分值推算出来的可信度分值；EValue:E()值(原始序列数据库大小矫正后的p-val分值)；GRAPHScan：预示它们相关性和同源性的分值(’I’=x＞35%,’i’=15%＜x＜35%，’’=x＜15%)
图3 PGK 9条指纹在华支睾吸虫PGK蛋白质序列中的匹配分布 (略)
通过对华支睾吸虫一未知蛋白的指纹鉴定显示(见表1、2)，PGK的9条指纹均与华支睾吸虫的9个基序相匹配，其中NoMotifs,SumId，AveId,ProfScore,Ppvalue,Evalue,GraphScan分别为9 of 9,56e+02,62,5676,14e-99,11e-94和IIIIIIIII都具有较高的分值，可信度高。目前，随着PRINTS数据库中数据的日益增加，通过蛋白质指纹对未知蛋白质序列进行鉴定及生物学功能的预测，它是一种特异性较高的生物信息学手段，也越来越多地被更多的科研工作者所采纳，但这种方法也存在一定的假阳性，这是我们在分析结果时须要注意的。
总之，磷酸甘油酸激酶的基因和蛋白质晶体结构已经在许多物种中都得到了充分的研究，而其生物学功能主要局限在糖酵解上，探索并发掘磷酸甘油酸激酶的其他生物学功能将是未来研究的重点所在。
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作者单位：中山大学中山医学院病原生物学部，广东 广州 510089