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摘要:目的 探讨基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMP）-2，9在中耳继发性胆脂瘤中的表达及其临床意义。 方法 应用免疫组织化学技术（SP法），检测MMP-2和MMP-9在中耳胆脂瘤和外耳道皮肤中的表达。 结果 34例中耳胆脂瘤MMP-2和MMP-9的阳性表达率分别为85.3%和91.2%，明显高于外耳道正常皮肤的50.0%和40.0%（P<0.05和P<0.01）。胆脂瘤上皮染色最强，多为中等至强阳性表达，胆脂瘤上皮组织各层细胞均有表达，基底膜染色强。 结论 MMP-2及MMP-9与胆脂瘤骨质破坏特性有关。
关键词:胆脂瘤;中耳;基质金属蛋白酶类
The significance of matrix metalloproteinases-2，9in the expression of human middle ear cholesteatoma.
FULi-ping，LUYi-sheng，WUHai-tao.（Department of Pathology of Dongguan Municipal People's Hospital，Dongguan523018，Guangdong，P.R.Chi-na）
Abstract:Objective To explore the expression of matrix metalloproteinase-2，9（MMP-2，MMP-9）and their clinical significance in human middle ear cholesteatoma. Methods Immunohistochemical S-P method was used to examine the expression ofMMP-2、MMP-9in34cases of acquired middle ear cholesteatoma and10cases of normal external acoustic meatus skin. Results Itwas found that the positive rates of MMP-2and MMP-9in34cases of middle ear cholesteatoma were85.3%（29/34）and91.2%（31/34）respectively.There was significant difference of the expression of MMP-2and MMP-9between cholesteatoma and external acoustic meatus skin（ante-rior P<0.05，posterior P<0.01）.The stain in cholesteatoma was stronger than that in external acoustic meatus skin.The positive ex-pression of MMP-2and MMP-9were mostly middle and strong，expressions of MMP-2and MMP-9were observed in all layers of the epithelial cells in cholesteatoma and the stain was strongest in basement membrane. Conclusion The results showed that the expressions of MMP-2and MMP-9are associated with bone destruction in middle ear cholesteatoma.
Key words:Cholesteatoma;Middle ear;Metalloproteinases
胆脂瘤型中耳炎最重要的临床特征和病理生理学过程就是可引起周围骨质吸收破坏，可导致严重的颅内、外并发症。然而，关于中耳胆脂瘤骨吸收破坏的分子机理尚不清楚。基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）是一类能够有效降解细胞外基质的锌离子依赖型的蛋白酶家族，其在骨质吸收和重建中的研究已经取得进展，其家族中的明胶酶基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9），可降解细胞间的基质成分及基底膜的主要成分IV型胶原蛋白，MMP-2和MMP-9的过度表达在炎症性骨溶解吸收破坏中起关键作用 ［1］ 。本研究采用免疫组织化学方法，检测MMP-2和MMP-9在胆脂瘤中的分布及表达水平，进一步探讨胆脂瘤骨质破坏的可能机制。
1 材料与方法
1.1 一般资料 收集1998年1月至2003年2月中耳胆脂瘤手术标本34例，经临床及病理检查确诊为后天继发性胆脂瘤。其中男20例，女14例，年龄9～65岁，平均38岁。取鼓室成形术中正常处耳道皮肤10例作为对照组。所有标本均经10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋。
1.2 试剂 单克隆抗体MMP-2、MMP-9鼠抗人抗体，均为即用型抗体，购于武汉博士德公司，SP试剂盒购于福州迈新公司。
1.3 方法 每例标本均经HE染色以明确病理诊断，作4～5μm厚连续切片。MMP-2及MMP-9均采用免疫组化SP法分别检测。石蜡切片脱蜡和水化，3%过氧化氢室温孵育10～20min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗3min×3;胰酶消化，37℃孵育20min，PBS冲洗3min×3;加非免疫性山羊血清，室温下孵育4min，PBS冲洗1次;加第1抗体MMP-2，4℃过夜，PBS冲洗3min×3;加生物素标记的羊抗鼠第二抗体，室温下孵育10min，PBS冲洗3min×3;加链亲和素过氧化物酶溶液，室温孵育10min，PBS冲洗3min×3;滴加新鲜配制的DAB，镜下控制显色时间;自来水冲洗，苏木精复染;脱水，透明，中性树胶封片。MMP-9检测步骤同前。用已知阳性对照片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。
1.4 结果判定 切片在显微镜下观察，以细胞内呈棕黄色颗粒的阳性反应产物为阳性，计数400倍镜下随意5个视野阳性表达细胞数所占的比例，按组织内阳性细胞数比例分为:阳性细胞数<10%为阴性（-）;阳性细胞数11%～25%为弱阳性（+）;阳性细胞数26%～50%为中等强度表达（++）;阳性细胞数>50%为强阳性（+++）。
1.5 统计学处理 两组间率的比较，采用χ 2 检验，统计 软件采用SPSS11.0版本。
2 结果
MMP-2和MMP-9在胆脂瘤组织及外耳道皮肤的表达分布，两者阳性染色为胞浆和胞膜出现棕黄色颗粒状，胆脂瘤上皮染色最强，多为中等至强阳性表达，上皮组织各层细胞均有表达，基底膜染色强，两者的表达分布相同，但从表达程度上看，MMP-9稍强于MMP-2。两者在外耳道皮肤标本均有不同程度的表达，染色多较弱，主要分布在基底细胞层的胞浆中。MMP-2和MMP-9在胆脂瘤和外耳道皮肤中的阳性表达见表1。 表1 MMP-2和MMP-9在胆脂瘤及外耳道皮肤中的阳性表达［例数（%）］
Table1 The positive expression of MMP-2and MMp-9in middbe ear cholesteatoma and external acoustic meatus skin（略）
表1结果显示，中耳胆脂瘤MMP-2和MMP-9阳性表达率分别为85.3%和91.2%，与外耳道皮肤对比差异有显著性（前者P<0.05，后者P<0.01）。
3 讨论
中耳胆脂瘤是一种炎性疾病，却具有肿瘤样的生物学行为，广泛破坏中耳腔结构和颞骨骨质。关于胆脂瘤如何导致骨质破坏的确切机理尚未完全明了。胆脂瘤常继发于慢性化脓性中耳炎，但在无胆脂瘤的慢性化脓性中耳炎中，明显的骨吸收非常少见，因此推测胆脂瘤本身是其骨吸收过程的必要因素 ［2］ 。
近年来，基质金属蛋白酶在中耳胆脂瘤中的作用渐渐受到关注。MMPs家族是一类能够降解绝大多数细胞外基质的肽链内切酶，它通过破坏细胞外基质，降解骨胶原，在许多病理生理过程中发挥十分重要的作用，如恶性肿瘤转移，组织重构 ［3］ 。目前发现，MMPs家族至少有16种酶，其中MMP-2和MMP-9是引起基底膜及细胞外基质降解的重要成分。有学者 ［4］ 对人类胆脂瘤中MMPs家族的表达进行了研究，发现MMPs家族成员在胆脂瘤以高度特异的方式表达，因此推测MMPs的高度表达可能参与胆脂瘤的骨吸收破坏过程。
本实验结果显示，胆脂瘤组织有较高的蛋白水解酶活性，MMP-2和MMP-9的高活性能够水解骨基质内胶原，参与骨质的降解，使胆脂瘤表现出侵袭性和骨破坏性，具有类似恶性肿瘤的生物学特性。本结果显示，胆脂瘤中MMP-2和MMP-9两者协同表达，表明两者在胆脂瘤破坏周围骨质中可能有一定的协同作用。MMP-2和MMP-9是基底膜的主要降解酶，胆脂瘤对周围骨质的破坏必须突破基底膜。有学者报道 ［5］ ，在炎症较重的胆脂瘤中，其基底膜不连续，缺乏IV型胶原的免疫反应物。MMP-2和MMP-9降解基底膜后形成的裂隙在胆脂瘤骨质破坏中可能起窗口作用，胆脂瘤产生的炎性递质和蛋白水解酶类通过裂隙与周围骨质接触，导致骨基质的降解。
总之，胆脂瘤的骨质破坏机制是一个复杂的过程，是多种因素起作用，多因素间又存在相互关系。MMP-2和MMP-9作为诸多因素之一，参与胆脂瘤的骨质破坏过程。
参考文献:
［1］ Clegg PD，Carter SD.Matrix metalloproteinase-2and-9are activated injoint diseases［J］.Equine Vet J，1999，31:324～330.
［2］ Banerjee AR，James R，Narula AA，et al.Martix metalloproteinase-1in cholesteatoma，middle ear granulations and deep meatal skin:a comparative analysis［J］.Clin Otolaryngol，1998，23:515～519.
［3］Mignatti，Rifkin DD.Bilogy and biochemistry of proteinases in tumor invasion［J］.Physiol Rev，1993，73:161～195.
［4］SchonermarkM，Mester B，Kempf HG，et al.Expression of matrix metallopro-teinases and their inhibitors in human cholesteatomas ［J］.Acta Otolaryngol，1996，116:451～456.
［5］Sudhoff H，Bujia J，Borkowski G，et al.Basement membrane in middle ear cholesteatoma immunohistochemical and ultrastructural observations ［J］.Ann Otol khinol Laryngol，1996，105:804～810.
作者单位:
1.东莞市人民医院病理科，广东东莞 523018;
2.上海复旦大学眼耳鼻喉科医院耳鼻咽喉科，上海 200000.