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摘要:目的 探讨混合核苷酸对刀豆蛋白A（Con A）所致肝损伤的保护作用。 方法 用Con A诱导小鼠肝损伤，用混合核苷酸灌胃治疗，3d后取血，检测血清ALT、AST活性和一氧化氮（NO）含量，检测肝组织超氧化物歧化酶（SOD）的活性和丙二醛（MDA）含量，并观察肝组织病理学变化。 结果 混合核苷酸大剂量组ALT、AST活性均明显低于模型组（P<0.01），但与联苯双酯组比较，差异无显著性意义（P>0.05）;混合核苷酸大、中剂量组肝组织SOD活性明显升高、MDA含量显著降低，与模型组比较，差异有显著性意义（P<0.05）;混合核苷酸大、中、小剂量组血清NO含量较模型组明显降低（P<0.05）;混合核苷酸中剂量组肝组织病理改变明显减轻。 结论 混合核苷酸对ConA所致小鼠肝损伤具有较好的保护作用，其保肝机制与抗脂质过氧化损伤和抑制NO的产生密切相关。
关键词:混合核苷酸;刀豆蛋白A;肝损伤;一氧化氮;超氧化物歧化酶;丙二醛中图分类号:R575.1
Protective effect of mixed nucleotide on liver injury in mice induced by concavalin A.LI Yue-mei 1 ，LI Xiang-yang 2 .（1.The First Affiliated Hospital of Guangzhou Traditional Medicine University，Guangzhou510405，Guangdong，P.R.China）
Abstract:Objective To investigate the protective effects of mixed nucleotides on liver injury in mice induced by concanavalin A（Con A）. Methods The model of liver injury induced by Con A was used for evaluating the therapeutic effects of Mixed nu-cleotides in mice.After3days of Mixed nucleotides was given to mice by gastric perfusion，their blood sample and liver tissue were taken，then serum transaminase（ALT，AST）activity and nitric oxide（NO）content were determined，the changes of liver pathological tissue were observed，And super oxide dismutase（SOD）activity and malondialdehyde（MDA）content in liver tissue were also deter-mined. Results Serum ALT，AST activity and NO content in lower dosage group of Mixed nucleotides obviously lower to that in modelgroup（P<0.01），but no significant difference comparing with that in bifendate group（P>0.05）.It showed that SOD ac-tivity and MDA content in liver tissue apparently decreased in both high and middle dosage groups of Mixed nucleotides，there is a significant difference comparing with model group（P<0.05）.NO content in three dosage groups of Mixed nucleotides obviously lowerto model group（P<0.05）.Hepatic histopathological changes were remarkable alleviated in middle dosage group of Mixed nu-cleotides. Conclusion Mixed nucleotides has a good protective effect on liver injury in mice induced by Con A，it may through the way of antilipoperoxidation and suppressing the release of NO.
Key words:Mixed nucleotides;Concanavalin A;Liver injury;Nitric oxide super oxide dismutase malondialdehyde
乙肝病毒持续感染是导致乙型肝炎慢性化、肝硬化和原发性肝癌的重要因素。目前认为乙肝病毒感染导致宿主免疫应答，是引起肝细胞损伤和出现相应临床表现的主要原因。混合核苷酸（Mixed nucleotides）是核糖核酸的酶解产物，由2'，3'-腺嘌呤核苷酸、2'，3'-鸟嘌呤核苷酸、2'，3'-胞嘧啶核苷酸、2'，3'-尿嘧啶核苷酸钠盐组成。这些成分为合成人体核酸和多种辅酶的前体物质之一，是细胞生命活动的重要物质，可增强肝细胞的代谢功能，提高肝组织的抗缺血、缺氧能力，临床用于治疗急慢性肝炎及肝损伤均有较好疗效，同时对能量代谢障碍性疾病也有一定疗效。但有关该药物的系统的药效学研究国内外均很少报道，本实验首次利用刀豆蛋白A所致的免疫性肝损伤动物模型，观察混合核苷酸对免疫性肝损伤的保护作用，以期为临床应用进一步提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料 NIH雄性小鼠，体重20-22g，广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号:SCXK（粤）2003-0002，粤监证字2004A018;刀豆蛋白A为美国华盛顿生物药品公司产品;联苯双酯滴丸为广州星群药业股份有限公司产品，批号:AF40046;混合核苷酸（MN），由陕西省科学院制药厂提供，批号:040312;谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）检测试剂盒均为上海生物制品有限公司提供;S0D、MDA、NO检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.2 方法 NIH雄性小鼠60只，随机分为正常对照组、模型组、混合核苷酸大剂量（1000mg/kg）、中剂量（500mg/kg）、小剂量（250mg/kg）以及联苯双酯（150mg/kg）等6组;除正常对照组外，其余各组小鼠于实验首日尾静脉注射ConA20mg/kg，分别于首日上午、下午和次日下午各灌胃给药1次。末次给药后4h，模型组和各给药组动物1次性尾静脉注射ConA20mg/kg。12h后摘眼球，取血分离血清，断头处死动物，取肝组织，一部分福尔马林溶液固定，另一部分制成匀浆待检。
1.2.1 ALT和AST测定 血液放置1h后分离血清按试剂盒说明测定ALT、AST活性。
1.2.2 肝组织SOD活性、MDA含量测定 小鼠肝脏以1.5g/L柠檬酸（M肝脏:V柠檬酸的比例为1:10）制成100g/L匀浆，按试剂盒说明操作，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量。
1.2.3 血清NO含量的测定 按试剂盒说明操作，硝酸还原比色法测定NO含量。
1.2.4 病理组织学检查 处死小鼠，取肝脏，观察其大体变化，并取固定肝组织，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察病理变化。肝细胞坏死分级:0级:无病变;Ⅰ级:肝细胞疏松肿胀，气球样变，有点状坏死。Ⅱ级:肝细胞灶性坏死。Ⅲ级:肝细胞广泛灶性坏死。炎性细胞浸润分级:0级:汇管区极少炎性细胞浸润;Ⅰ级:汇管区、血管窦可见多个炎性细胞浸润;Ⅱ级:汇管区、肝小叶内炎性细胞浸润明显，肝实质破坏;Ⅲ级:汇管区大量炎性细胞浸润，肝实质破坏。
1.2.5 统计学方法 采用SPSS10.0软件包进行统计分析，多组计量资料分析采用One-way ANOVA，多重比较采用LSD;多组等级资料的分析采用Kruskal-Wallis检验，两两比较采用Nemenyi法。
2 结果
2.1 对小鼠血清ALT、AST活性的影响 模型组小鼠ALT、AST活性较正常对照组明显升高，两者比较差异有显著性意义（P<0.01）。混合核苷酸中剂量组ALT、AST活性均明显低于模型组，差异有显著性意义（P<0.01），但与联苯双酯组比较，差异无显著性意义（P>0.05）。混合核苷酸大、小剂量组ALT活性明显低于模型组，差异有显著性意义（P<0.01）。结果见表1。表1 混合核苷酸不同剂量对ConA所致肝损伤小鼠血清ALT、AST活性的影响（略）
2.2 对小鼠肝组织SOD活性、MDA含量及血清NO含量的影响 模型组小鼠肝组织MDA和血清NO含 量较正常组明显升高，SOD活性较正常组明显降低，差异均具有显著性意义（P<0.01）。其余各组的SOD、MDA和NO结果见表2。表2 混合核苷酸不同剂量对ConA所致肝损伤小鼠肝组织SOD活性、MDA含量及血清NO含量的影响（略）
2.3 肝脏病理组织学观察 模型组肝脏发生明显变化，肉眼可见肝脏表面及肝实质内有斑点坏死灶，光镜下可见大多数肝细胞肿胀，细胞质疏松化，有的呈气球样变，可见凋亡小体、肝细胞点状坏死和灶性坏死，尤以汇管区明显，坏死灶内有大量炎性细胞浸润。混合核苷酸中剂量组和联苯双酯治疗组肝细胞坏死程度减轻，炎性细胞浸润显著减少，与模型组相比，病理变化明显改善，采用Kruskal-Wallis法进行检验，结果显示组间差异具有显著性意义（Hc=30.34、30.71，P<0.01），采用Nemenyi法两两比较，显示混合核苷酸中剂量组和联苯双酯组肝细胞坏死、炎性细胞浸润病理改变均明显低于模型组，差异具有显著性意义（P<0.05）。见表3。 表3 混合核苷酸不同剂量对Con A所致肝损伤小鼠肝脏病理改变的影响（略）
3 讨论
ConA诱导的小鼠免疫性肝损伤模型，被认为更适合研究人类病毒性肝炎和自身免疫性肝病的病理机制和进行抗肝损伤的药物筛选 ［1，2］ 。辅助性T细胞（TH细胞）和巨噬细胞是该动物模型的效应细胞。ConA活化TH细胞后刺激TH细胞和巨噬细胞共同产生过量的IFN-γ和TNF-α等细胞因子，已证实TNF-α为细胞因子网络中介导肝损伤的终末介质，它既是肝细胞凋亡的正性触发因子，且直接损伤血管内皮细胞，亦可活化中性粒细胞促进其趋化聚集于肝脏，释放蛋白酶或氧自由基引起肝细胞凋亡或坏死 ［3，4］ 。TNF-α、IL和IFN-γ等细胞因子及内毒素等刺激物可诱导非Ca 2 +依赖性的诱导型NOS产生大量NO，且与ALT水平呈正相关 ［5］ 。NO是一种新型的细胞信使分子和细胞毒性因子，高水平NO导致细胞毒性作用，并介导免疫损伤。实验表明NO对肝细胞功能的影响是多方面的，NO可抑制肝细胞蛋白质合成和线粒体功能，抑制核糖核苷酸还原酶及破坏DNA双螺旋结构，诱导肝细胞凋亡及坏死，并参与肝细胞的氧化损伤过程 ［6，7］ 。
本研究证明混合核苷酸对ConA诱导的肝损伤有明显的保护作用，以大剂量组效果较为明显，表现为血清ALT和AST活性降低、肝损伤病理改变减轻;混合核苷酸三个剂量组小鼠血清NO的含量均显著降低，大剂量、中剂量组肝组织SOD的活性明显升高、MDA含量显著降低，与模型组比较，差异有显著性意义（P<0.05），说明混合核苷酸的保肝机制与其抗脂质过氧化损伤及抑制NO的产生密切相关，从而为混合核苷酸治疗乙型肝炎及免疫性肝损伤等疾病提供了理论基础，具有一定的临床应用价值。这可能是因为一方面混合核苦酸可刺激机体产生抗体及提高肠道对铁的吸收;促进造血机能，增加白细胞和血小板的生成;另一方面这些成分是合成人体核酸和多种辅酶的前体物质之一，是细胞生命活动的重要物质，参与体内核酸代谢和能量代谢，活化丙酮酸氧化酶系，提高辅酶A活性，使处于低能、缺氧状态下的组织细胞继续顺利进行代谢。所以可增强受损免疫系统的功能，使恢复至正常水平。混合核苷酸对在T细胞介导的细胞免疫反应中起重要作用的TNF-α、IFN-γ等细胞因子有何影响，则有待实验进一步探讨。
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作者单位:1.广州中医药大学第一附属医院针灸科，广东广州 510405;
2.广州中医药大学热带医学研究所，广东广州 510405.
作者简介:李月梅（1971～），女，硕士毕业，主治医院，主要从事中医针灸临床科研工作.
收稿日期:2005-04-01