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The detection of mutation on mitochondrial DNA and analysis in leber hereditary optic neuropathy
Guan Weili，Yuan Guogang，Wang Yunxu，et al.
The First Hospital of Tongliao City Ke’erqin District，Mongolia Autonomous Region028000
【Abstract】 Objective To detect and analyze3mutations at np3460，11778，14484on mitochondrial DNA in a pedigree associated with Leber hereditary optic neuropathy.Methods The mitochondrial DNA of peripherial blood was amplified by PCR.After digestion of PCR producted by HinI1SfaN1and Sau3A1，we investigated if the mutation of miˉtochondrial DNA existed.Results The mutation at np11778was identified in most members of this pedigree while the mutation at np3460and14484were not identified in all the cases.Conclusion The members with Leber hereditary opˉtic neuropathy have a point mutation in mtDNA and the mutation at np11778is one of mechanisms inducing this disease.PCR technique provides a useful diagnostic aid for LHON.
Key words leber hereditary optic neuropathy mitochondria DNA mutation polymerase chain reaction Leber
遗传性视神经病变（Leber hereditary optic neuropathy，LHON）系一种主要累及视盘黄斑束纤维，导致视神经退行性变的遗传性疾病。其主要病因是线粒体DNA某些位点发生突变，是一种最为常见的线粒体遗传病。LHON的遗传特性为:母系遗传。笔者对一LHON家系16名成员及1名非LHON家系的正常对照者，应用聚合酶链反应（PCR）和限制性核酸内切酶酶谱分析技术 ［1，2］ ，进行mtDNA核苷酸位点（3460 ［3］ 、11778 ［4］ 、14484 ［5］ ）的突变检测，现将结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 资料来源 本家系共26例，其中13例患病，已故者2例，其患病情况仅通过亲属了解。抽取其中16例家系成员外周血，设非LHON家系正常对照究室 1名。见图1（略） 注:LHON家系图:Ⅱ 2，3，4，6，7 ;Ⅲ 1，2，5，7，8，9，11，13，14 ;Ⅳ 1，4 为被采集血样标本者，≯先证者。 图1 家系谱
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取 取研究对象新鲜血液5ml，ACD抗凝，用DNA提取试剂盒按常规方法提取DNA。
1.2.2 PCR 应用Pcrdesn软件系统，在第3460、11778 ［6］ 、14484这3个核苷酸位点的上、下游分别设计引物 ［7］ ，并对正常对照及16份标本进行PCR扩增。PCR反应在25μl体系中进行，反应液含:2.0μl（0.5μg）的模板DNA，5’端引物和3’端引物各1.5μl（30pmol），1.5μl（各3.75nmol）的dNTPs，2.5μl（62.5nmol）的MgCl 2 ，1μl（1u）的Tag酶，以及相应的缓冲液。PCR反应条件如下:94℃预变性5min;94℃变性50s，50℃～55℃退火50s，72℃延伸50s，循环周期34次;最后，72℃延伸5min。
1.2.3 酶解 分别用3种限制性核酸内切酶HinI1，SfaN1及Sau3A1消化3组PCR产物。酶解反应在20μl体系中进行，反应液包括:5.0μl的PCR产物，1.0μl（1u）的限制性核酸内切酶，以及相应的缓冲液。酶解反应条件如下:37℃，2h。
1.2.4 电泳 2%琼脂糖凝胶中120V电泳30min，紫外线下观察，拍照，记录结果。
2 结果
2.1 第一组实验PCR产物及酶解产物电泳结果 正常对照和16份标本的PCR产物全部被限制性核酸内切酶HinI1消化为146bp和47bp两个片段。见图2。
2.2 第二组实验PCR产物及酶解产物电泳结果 除正常对照和6号标本的PCR产物被限制性核酸内切酶SfaN1消化为175bp和24bp两个片段外，其余15份标本均未被消化。见图3。
2.3 第三组实验PCR产物及酶解产物电泳结果 正常对照和16份标本的PCR产物全部被限制性核酸内切酶Sau3A1消化为98bp和19bp两个片段。见图4。
3 讨论
Leber遗传性视神经病变是母系遗传的一种视神经损伤性眼病，线粒体DNA突变被认为是LHON的特异性改变。1988年Wallace首先研究得出结论LHON的发生是线粒体DNA突变所造成的，第11778核苷酸G→A突变，此后，Johns DR又发现了线粒体DNA第3460核苷酸和14484核苷酸突变的存在。目前，国内外有关LHON的mtDNA突变报道共涉及25个位点，其中原发突变超过5种，大多数突变位于编码NADH脱氢酶亚单位的区域内，最常见的是11778/ND4（G→A） ［8～11］ 、14484/ND6（T→C）（10）和3460/ND1（G→A） ［10］ ，超过95%的LHON患者主要是这3个mtDNA核苷酸之一发生突变的结果，其中第11778核苷酸突变约占全部的50%～52%。 本实验采用PCR-限制性核酸内切酶酶谱分析法，检测mtDNA有无突变存在，3限制性核酸内切酶HinI1，SfaN1及Sau3A1在所扩增的ND1、ND4和 ND6亚单位片段中，分别有特定的切割识别序列，如核苷酸未发生突变，则原有限制性核酸内切酶所识别序列存在，故PCR产物被限制性核酸内切酶由一个完整的片段被消化成两个片段;如核苷酸发生突变，则原有限制性核酸内切酶所识别序列不复存在，故PCR产物无法被上述限制性核酸内切酶所消化。限制性核酸内切酶SfaN1的识别序列是GCATC↓，其中黑体的G为第11778核苷酸，正常对照和6号家系成员的mtDNA经PCR特异性扩增后，用限制性核酸内切酶SfaN1消化呈现出175bp和24bp两个片段，而其余15份标本的mtDNA经PCR特异性扩增后，不能被限制性核酸内切酶SfaN1消化。实验结果说明，正常对照和6号家系成员的mtDNA存在着SfaN1的识别序列，而其余15位家系成员的这一识别序列丧失，则有mtDNA第11778核苷酸突变存在。同理，正常对照和16位家系成员的mtDNA经PCR特异性扩增包括第3460核苷酸和第14484核苷酸，产物片段用限制性核酸内切酶HinI1和Sau3A1消化分别呈现出146bp、47bp两个片段和98bp、19bp两个片段，实验结果说明，正常对照和16位家系成员的tDNA存在着HinI1和Sau3A1的识别序列，没有第3460核苷酸和第14484核苷酸突变。mtDNA呈母系遗传方式，由于受精时精子仅细胞核进入受精卵，合子的细胞质全部由卵子提供，因此父亲不能把他的mtDNA传给子代，而母亲则把她的mtDNA传递给子代。在本家系中，以先证者为例，先证者及其母亲是该家系的患者，有mtDNA第11778核苷酸突变存在，其外祖母已故，追溯病史也是该家系的患者，而6号成员是男性后代，他和正常对照一样不存在mtDNA第11778核苷酸突变，说明本家系成员的患病情况符合mtDNA的母系遗传特征。
家系中有发生mtDNA第11778核苷酸突变的正常成员，尽管他们没有发生眼病，但是他们却存在mtDNA第11778核苷酸突变，因此他们是携带者。在LHON家系中，野生型和突变型线粒体DNA分子可并存于同一个细胞内，而不同组织的细胞中野生型分子和突变型分子间的比例可相差很大，是否发病与特定组织中突变型分子所占比例是否达到一定的阈值有关 ［12］ ，所以有点突变的个体并非全都是患者，可以是携带者。目前认为，突变阈值达到60%才发生疾病的表达。通过本实验，证明了该LHON家系成员存在线粒体DNA点突变，mtDNA的ND4亚单位第11778核苷酸突变是本病的发病机制之一，此外，本实验方法为LHON的临床诊断和鉴别诊断提供了一个可靠的检测诊断依据。（本文图片见封三）
参考文献
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作者单位:028000内蒙古通辽市科尔沁区第一人民医院眼科
130021北京军事医学科学院放射医学研究所免疫学研