胰岛素样生长因子在人胎盘绒毛滋养层细胞的基因表达

　　摘要:目的 探讨胰岛素样生长因子系统（IGFs）在体外培养的胎盘绒毛滋养层细胞中的基因表达及其作用。 方法 采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测58例体外培养的胎盘绒毛滋养层细胞中IGF-ImRNA、IGF-IImRNA、IGF-IRmRNA、IGF-IIRmRNA、IGFBP-1mRNA、IGFBP-2mRNA、IGFBP-3mRNA、IGFBP-4mRNA、IGFBP-5mRNA、IGFBP-6mRNA等10种胰岛素样生长因子的基因表达。 结果 58例体外培养的胎盘绒毛滋养层细胞均有IGF-ImRNA、IGF-IImRNA的基因表达;56例存在IGF-IRmRNA、IGF-IImRNA、IGFBP-3mRNA的基因表达;2例同时检测出上述10种基因。 结论 IGFs可能在早期细胞滋养层的侵入、增殖分化、胎盘形成和胚胎生长发育过程中以自分泌或旁分泌方式发挥重要的调节作用。
   
　　关键词:胰岛素样生长因子;滋养层细胞;基因

　　In vitro genetic expression of insulin-like growth factor in huaman villous trophoblast cell in early pregnancy.

　　HUANG Wei-jia，XIAO Gui-chu，XIAO Xiao-you，et al.

　　（Laboratory Department of Shenzhen Municipal Fourth People's Hospital，Shenzhen518033，Guangdong，P.R.China）
   
　　Abstract:Objective To investigate the gene expression and action of insulin-like growth factors（IGFs）in human villous tro-phoblast cells of early pregnancy in vitro. Methods Reverse transcriptase polymerase chain reaction（RT-PCR）was used for determining the expression of GFs（IGF-ImRNA，IGF-IImRNA，IGF-IRmRNA，IGF-IIRmRNA，IGFBP-1mRNA，IGFBP-2mRNA，IGFBP-3mRNA，IGFBP-4mRNA，IGFBP-5mRNA，IGFBP-6mRNA）messenger RNA in human villous trophoblast cells of58early pregnancy cases in vitro. Results The expression of IGF-ImRNA，IGF-IImRNA was detectable in human vil-lous trophoblast cells of58early pregnancy cases in vitro，IGF-IRmRNA，IGF-IImRNA and IGFBP-3mRNA were detectable in56early pregnancy cases and ten IGFs were detectable in2early pregnancy cases. Conclusion IGFs appear to play important reg-ulation roles in early invasion，proliferation and differentiation of cytotrophoblast，and in the formation of placenta and the develop-ment of embryo via autocrine or paracrine way.
   
　　Key words:Insulin-like growth factors;Trophoblast cell;Gene
      
　　胎盘是胎儿与母体之间进行物质交换的重要器官，为胎儿生长提供适宜的宫内环境，胎盘的正常发育及其功能是决定胎儿正常发育的关键因素。人胎盘绒毛滋养层细胞对研究胎盘绒毛在妊娠期间的作用及其机制有很重要的生物学意义。近代研究发现，在人胎盘上有许多生长因子表达，其中有部分生长因子对胎盘功能的影响尚未清楚。胰岛素样生长因子结构类似胰岛素，具有促进细胞分化增殖、生长代谢等多种生物学效应。胎盘是第一个被确定表达IGFs受体的器官，因而被认为是IGFs的重要靶器官。本实验旨在探讨IGFs在体外培养的人胎盘滋养层细胞中的基因表达及其功能。

　　1 材料与方法
   
　　1.1 标本来源 选择2004年4月～2005年10月怀孕5～7周做人工流产的健康孕妇58例，HCV感染指标阴性，年龄18～35岁，月经规则，经B超证实为宫内正常胚胎，术前3个月内未用过甾体类激素及抗早孕药物，行无菌人工流产术获得新鲜胎盘绒毛组织。
   
　　1.2 仪器和试剂 PE9600PCR扩增仪、DYY-III2电泳仪、TW-20凝胶成像系统、恒温水浴箱、3700型DNA全自动测序仪;胶原酶II、胰蛋白酶、RPMI1640培养液、兔抗人绒毛膜促性腺激素（HCG）多克隆抗体、SV TOTAL RNA ISOLATION SYSTEM试剂盒、ONE STEP RT-PCR KIT及DNA MARKER DL2000试剂、PCR引物由美国Gibco公司合成。

　　1.3 方法
   
　　1.3.1 绒毛滋养层细胞的分离培养 在无菌超净工作台中用冰冷的D-Hank液（含青霉素100U/ml和链霉素100μg/ml）反复漂洗去除胎盘绒毛组织上的血块及粘液等杂质，剪成碎片后置37℃恒温水浴箱中，用已预温至37℃改良的胰蛋白酶（由0.25%的胰蛋白酶和0.1%的胶原酶II以2:1的比例混合而成）振荡消化2次，每次5～10min。细胞悬液用100目筛网过滤，1200r/min离心6min后弃上清，细胞用20%RPMI-1640培养液（含20%胎牛血清、2mmol/L-谷氨酰胺、20mmol/L Hepes、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素）洗2次，以1×10 5 /ml的细胞密度接种于培养瓶中，37℃含5%CO 2 培养箱中培养24h后换液去除未贴壁细胞。以后根据细胞生长情况每2～3d换液1次。当细胞长满瓶底的90%左右时，用消化液（0.25%胰蛋白酶与0.02%EDTA以1:1比例混合）消化贴壁细胞，传代后一部分用盖玻片法培养鉴定细胞纯度，另一部分进行IGFsmRNA基因表达的检测。

　　1.3.2 细胞纯度鉴定 待细胞爬片基本长满时，取出盖玻片，用-20℃纯丙酮固定15min，加兔抗人绒毛膜促性腺激素（HCG）多克隆抗体（1:150），阴性对照用PBS代替，4℃过夜，依次加生物素标记的羊抗兔第二抗体（1:200）及LsAB复合物（1:200），以DAB-H 2 O 2 显色。阳性结果为细胞内出现棕黄色颗粒。
   
　　1.3.3 IGFsmRNA基因表达的检测 体外培养的胎盘绒毛滋养层细胞总RNA的提取严格按照说明书操作，并测定RNA样品在波长为260nm和280nm时的紫外光吸收值（A），A260/A280大于1.80，根据A260估算RNA的浓度，甲醛变性凝胶电泳鉴定RNA的完整性。RT-PCR严格按照操作说明书进行，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像系统观察分析结果。经过凝胶回收纯化的RT-PCR产物以3700型DNA全自动测序仪进行测序。

　　2 结果
   
　　2.1 58例体外培养的人胎盘绒毛滋养层细胞纯度鉴定阳性细胞率达到98%以上。
   
　　2.2 体外培养的人胎盘绒毛滋养层细胞形态特征 新鲜分离的绒毛滋养层细胞呈不同大小的细胞团，单个细胞悬浮时呈圆形。培养3h后开始贴壁，18h后基本全部贴壁;贴壁细胞多呈上皮细胞样生长，形态多样，个别细胞呈纤维细胞样。24h后开始出现多个核细胞并随时间推移逐渐增大，成片生长。
   
　　2.3 IGFsmRNA在体外培养的人胎盘绒毛滋养层细胞中的基因表达:58例体外培养的胎盘绒毛滋养层细胞均有IGF-ImR-NA、IGF-IImRNA的基因表达;56例存在IGF-IRmRNA、IGF-IImRNA、IGFBP-3mRNA的基因表达;2例同时检测出上述10种基因。以上RT-PCR产物经DNA测序证实了基因表达的真阳性。
   
　　3 讨论
   
　　在妊娠不同阶段的胎盘组织中存在多种不同类型的滋养层细胞，包括未分化的单个核滋养层细胞前体即细胞滋养层细胞;具有内分泌活性的绒毛滋养层细胞;负责将绒毛固定于蜕膜Nitabuch's层的连接滋养层细胞;可迁移入蜕膜、子宫肌层和子宫螺旋动脉的侵袭性滋养层细胞;含有多个细胞核、位于漂浮绒毛表面参与母胎物质交换的合体滋养层细胞。胰岛素样生长因子系统（IGFs）由IGFs、IGF受体（IGFR）、IGF结合蛋白（IGFBPs）组成。IGFs可分为IGF-I和IGF-II;IGFR又可分为IGF-IR和IGF-IIR;IGFBPs可分为IGFBP 1 、IGFBP 2 、IGFBP 3 、IGFBP 4 、IGFBP 5 、IGFBP 6 6种基因结构和蛋白结构。
   
　　实验研究发现，58例体外培养的5～7周人胎盘绒毛滋养层细胞中均有IGF-ImRNA、IGF-IImRNA的基因表达;56例存在IGF-IRmRNA、IGF-IImRNA、IGFBP-3mRNA三种基因的表达，其阳性表达率占96.6%;2例同时检测出上述十种基因，阳性表达率为3.4%。胎盘本身可以合成IGF-I和IGF-II，以后者为主。胚胎期间IGF-I的表达水平较低，而且不依赖于生长激素的调节。体内许多组织都能合成IGF-II，成人血浆中IGF-II的水平高于IGF-I，胎儿血浆IGF-II的水平又高于成人，提示IGF-II可能在胎儿生长发育过程中起非常重要作用。实验发现IGF-II的胰岛素样代谢作用比IGF-I强，但IGF-II的促细胞分裂作用较IGF-I为弱 ［1～2］ 。体内和体外实验研究表明整个妊娠期间胎盘及胎膜组织均能分泌IGF-I和IGF- II;胎盘中IGF-ImRNA主要表达于分化的合体滋养层细胞中;用原位杂交法研究结果显示IGF-IImRNA分布于绒毛膜中胚层与妊娠早期绒毛及绒毛外细胞滋养层细胞（CTB）内 ［3］ ，最近研究显示滋养层细胞通过分泌IGF-II抑制蜕膜细胞TIMP-3与IGFBP的表达而促进其浸润 ［4］ 。高水平的IGF-IImRNA定位于快速增殖的CTB中，可能对早孕时滋养层细胞的扩展尤为重要。
   
　　IGFs必需与IGFs受体结合才能发挥其生理作用，IGFs对胎盘的作用包括促进DNA的合成和类固醇产生。IGF-IR是生长发育过程中极为关键的因子之一，IGF-II是否通过其受体促进细胞生长目前尚不清楚。IGF-I受体和IGF-II受体基因敲除实验发现，敲除任何IGF受体都将导致胎儿生长停滞，敲除IGF-II/M6P受体甚至可以导致胎儿死亡 ［5～6］ 。
   
　　IGFBP 1 首先是从胎盘组织中分离的，人类子宫内膜、蜕膜和胎儿的肝均可高效表达IGFBP 1 mRNA。IGFBP 3 是血浆中含量最高的IGFBP，循环中95%以上的IGF被IGFBP 3 结合。IGF-BP 1 、IGFBP 3 、IGFBP 4 和IGFs具有相同的亲和力，而IGFBP 2 、IGF-BP 5 、IGFBP 6 与IGF-II亲和力较高。IGFBP 1 、IGFBP 3 和IGFs结合后，起加强或抑制IGFs的作用，IGFBP 2 、IGFBP 4 、IGFBP 6 主要起抑制作用，IGFBP 5 则加强IGFs的作用。IGFBPs对胎盘功能的影响目前尚未完全清楚，可能对子宫内组织产生的IGF起调节作用。
   
　　在妊娠早期，IGF-I和IGF-II可能参与胎盘细胞滋养层细胞的增生和分化，在胎盘形成和植入子宫内膜中起重要作用。IGF与受体结合发挥其生物学效应;IGFBP则与受体进一步结合IGF，延长IGF的半衰期以及调节其作用。所以认为IGFs可能在早期细胞滋养层的侵入、增殖分化、胎盘形成和胚胎生长发育过程中以自分泌或旁分泌方式发挥重要的调节作用。

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