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摘要:目的 研究表皮生长因子受体（EGFR）在妊娠滋养细胞疾病的表达，探讨EGFR对预测葡萄胎恶变的价值。 方法 采用免疫组化方法，检测石蜡包埋的105例妊娠滋养细胞疾病和20例正常早孕绒毛组织EGFR蛋白表达水平。 结果 在合体滋养层中，妊娠滋养细胞疾病和正常早孕绒毛组织均强烈表达EGFR蛋白;在细胞滋养层，正常早孕绒毛、非恶变组葡萄胎的EGFR蛋白表达显著高于恶变组葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒癌（P<0.01，P<0.01，P<0.01），而恶变组的EGFR蛋白表达显著高于侵蚀性葡萄胎和绒癌（P<0.05，P<0.05），EGFR蛋白表达在侵蚀性葡萄胎和绒癌之间差异无显著性（P>0.05）。 结论 EGFR表达降低在妊娠滋养细胞疾病发生发展过程中起重要作用并有可能成为预测葡萄胎恶变的一项新的指标。
关键词:葡萄胎;滋养层肿瘤;表皮生长因子受体;免疫组织化学
Investigation into the relationship between the expression of epidermal growth factor receptor and gestational tro-phoblastic disease.
LI Hua-wen，LI ying-yong，CHEN Zhong-wen.
（Zhaoqing Municipal First Hospital，Zhaoqing526021，Guangdong，P.R.China）
Abstract:Objective To investigate the expression of epidermal growth factor receptor（EGFR）in gestational trophoblastic dis-ease（GTD）and its value in prognosis of hydatidiform mole. Methods 105cases of GTD and20cases of normal chorion villi tis-sue specimens were examined by immunohistochemical techniques using EGFR monoclonal antibody. Results Stain for EGFR was detected in all cell types of trophoblasts in GTD and normal chorion villi.In syncytiotrophoblasts（ST），expression of EGFR protein were strong in GTD and normal chorion villi，and no significant differences were observed among them.In cytotrophoblasts（CT），ex-pression of EGFR protein was significantly higher in normal chorion villi and non-malignant transforming groups（NMTG）as com-pared to those in malignant transforming group（MTG），invasive hydatidiform mole and choriocarcinoma（P<0.01，P<0.01，and P<0.01，respectively）.Furthermore，expression of EGFR protein was significantly higher in MTG as compared with that of inva-sive hydatidiform mole and choriocarcinoma groups（P<0.05，and P<0.05，respectively）.There was no significant difference in EGFR protein expression between invasive hydatidiform mole and choriocarcinoma groups（P>0.05）.Size of the uterus and pres-ence of the lutein cysts were closely associated with hydatidiform mole malignant transformation. Conclusion Decreased expression of EGFR may play a vital role in pathogenesis of GTD and the detection of EGFR may provide a new way in predicting malignant transformation of hydatidiform mole.
Key words:Hydatidiform mole;Gestational trophoblasti tumor;EGFR;Immunohistochemisty
葡萄胎是胚胎外层的滋养细胞发生变性、绒毛水肿而形成的水泡状物，具有生长活跃及潜在恶性的特点，其中约10%～20%将发展为侵蚀性葡萄胎或绒癌。目前滋养细胞疾病虽在治疗上已取得较为满意的效果，但其发病机理、恶变相关因素、预后评估等仍未明了，及早发现恶变的葡萄胎对治疗有重要意义。本研究采用免疫组化SP法对105例妊娠滋养细胞疾病和20例正常早孕绒毛组织的EGFR表达进行检测，同时对葡萄胎的临床因素与葡萄胎恶变的相关性进行研究，寻找早期预测葡萄胎恶变的方法。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集1995年1月～2000年4月因葡萄胎住院首次清宫标本65例，其中35例为清宫后又因发展为侵葡或绒癌而到医院化疗的恶变者（下称恶变组），年龄19～50岁，平均（32±8）岁，30例为随访2年未恶变者（下称非恶变组），年龄21～47岁，平均（29±7）岁;因侵蚀性葡萄胎或绒癌而手术切除的子宫标本各20例，年龄28～56岁，平均（40±9）岁。全部病例均参照宋鸿钊法诊断 ［1］ ;选取2001年4月在门诊行人工流产的健康妇女早孕绒毛组织20例作为对照，年龄20～43岁，平均（28±9）岁。
1.2 方法 采用免疫组织化学染色S-P法，鼠抗人EGFR单克隆抗体及SP免疫组化试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司，操作方法按试剂盒说明进行。DAB染色，苏木素复染。用EGFR阳性片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。
1.3 结果判断标准 以细胞膜或细胞浆内出现明确的棕黄色颗粒为阳性细胞，采用双盲法对每张切片在高倍镜（10×40）下计数10个视野，每个视野数100个细胞，计阳性细胞数。将染色强度计分（0为无着色;1为浅褐色;2为棕褐色;3为深棕褐色）和阳性细胞百分率计分（0为无阳性细胞;1为1%～25%;2为26%～49%;3为>50%）相加为EGFR免疫组化计分，并以0分为（-），2分为（+），3～4分为（++），5～6分为（+++）。
1.4 统计学处理 实验数据用SPSS10.0软件包，采用等级资料秩和检验及多因素Logistic回归分析方法进行统计学分析。
2 结果
2.1 EGFR免疫组化定位 EGFR阳性颗粒在合体滋养层细胞和细胞滋养层细胞均有表达，主要定位于细胞膜，亦可在部分胞浆中表达，间质细胞不表达。
2.2 EGFR免疫组化半定量分析 EGFR蛋白在正常早孕绒毛、非恶变组葡萄胎、恶变组葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒癌的合体滋养层强烈表达，其之间EGFR蛋白的表达差异无显著性（P>0.05）。在细胞滋养层，正常早孕绒毛EGFR蛋白的表达与非恶变组葡萄胎差异无显著性（P>0.05），但显著强于恶变组葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒癌（P<0.01）;恶变组葡萄胎的表达显著弱于非恶变组（P<0.01），并且强于侵蚀性葡萄胎和绒癌的表达（P<0.05）;侵蚀性葡萄胎和绒癌之间表达无差异。见表1。
表1 EGFR蛋白在正常早孕绒毛和妊娠滋养细胞疾病的表达（略）
Table1 Expression of Rb protein in GTD and normal chorion villi
注:※与恶变组葡萄胎、侵蚀性葡萄胎、绒癌比较，P<0.01;※※与非恶变组葡萄胎比较，P<0.01;与侵蚀性葡萄胎、绒癌比较，P<0.05。
2.3 葡萄胎临床因素与恶变的关系 对患者年龄、妊娠次数、清宫前停经时间、子宫增大程度、卵巢黄素化囊肿、ABO血型、滋养层增生程度与葡萄胎恶变进行的多因素Logistic回归分析。结果表明，葡萄胎恶变与子宫增大、卵巢黄素化囊肿呈正相关，分析结果分别是（回归系数β=2.771，标准误SE=0.966，Wald卡方值=7.745，P=0.005;回归系数β=2.465，标准误SE=1.277，Wald卡方值=3.728，P=0.49），见表2。
表2 葡萄胎恶变与临床指标的关系（略）
Table2 Logistic regression analysis of multiple factors in hydatidiform mole
3 讨论
3.1 EGFR是原癌基因c-erbB-1（也称HER-1或erbB-1）的表达产物，和erbB-2在基因序列上至少有50%的同源性，分子量为170kD。EGFR通过与配体结合使酪氨酸蛋白激酶激活以及自身的自动磷酸化在细胞信息传递过程中起很重要的作用。在对肿瘤与EGFR的相关性研究中，发现部分肿瘤发生了EGFR的过度表达、基因扩增及基因重组。近年来，应用体外细胞培养和动物实验模型进行更深入研究，提出和证实EGFR可通过旁分泌途径、自分泌环路以及影响其配体的表达等机制而促进肿瘤细胞增殖 ［2，3］ 。
3.2 正常妊娠的维持是胚胎与母体之间协同作用的极其复杂的过程，正常早孕绒毛滋养层细胞也有类似恶性肿瘤的特点。本实验结果提示EGFR蛋白在合体滋养层和细胞滋养层中均有表达。早孕绒毛、葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒癌的合体滋养层全部强烈表达EGFR蛋白，它们之间没有统计学差异。在细胞滋养层中，随着GTD恶性程度的增加，EGFR蛋白的表达量及表达率均下降;葡萄胎的细胞滋养层EGFR蛋白的表达在葡萄胎首次清宫甚至尚未诊断恶变时，将来恶变组和非恶变组的葡萄胎已经存在差异，说明细胞滋养层EGFR蛋白表达降低是葡萄胎恶变的早期事件，并且在GTD恶性进展过程中起重要作用。在对滋养层细胞的研究中发现，细胞滋养层的增殖与GTD进展的关系较密切，并且增殖程度重者表达增殖细胞核抗原（PCNA）也较强，而合体滋养层主要起分泌激素功能（如:hCG、hPL等） ［4，5］ 。Ladines等 ［6］ 的研究结果也发现EGFR在恶性GTD的表达较良性者减弱，并且认为EGFR通过自分泌途径影响肿瘤的生物行为。许多研究表明，EGFR过度表达与肿瘤的恶性程度呈正相关，但为何在滋养细胞的恶性转化中EGFR的表达反而降低，推测可能的机制为 ［7］ :（1）正常滋养细胞需要较多量EGFR促进其适当的增殖分化，一旦恶变转化发生，细胞将会失去其正常的调节机制，包括产生EGFR;（2）erbB2与EGFR高度同源，通过旁分泌途径使得EGFR模拟转化细胞的特性，使细胞恶变;（3）恶性滋养细胞中，由于EGF或TGFa与EGFR结合，导致EGFR内源性降解，使EGFR降调至低水平;（4）在恶性转化细胞，碱性成纤维细胞生长因子可以产生并结合受体，使细胞表面的生长因子受体不识别配体，即可激发细胞内生长反应。EGFR在其它肿瘤的研究过程中也有肿瘤组织较周围正常组织EGFR表达降低的发现 ［8］ 。3.3 在对葡萄胎恶变与临床特征的多因素回归分析中，发现子宫增大大于相应妊娠月份或合并卵巢黄素化囊肿的葡萄胎恶变危险性高，而与患者年龄、妊娠次数、清宫前停经时间、ABO血型及滋养层增生程度没有显著相关性。Ayhan等 ［9］ 对82例葡萄胎患者进行了回顾性研究发现孕妇年龄大是葡萄胎恶变的高危因素。Lorigan等 ［10］ 就血型与葡萄胎发病的关系研究发现，英国南部人群中，B型血的妇女发生葡萄胎妊娠的机会比普通人群高;在印度和巴基斯坦人群中，B型血葡萄胎患者发生二次葡萄胎妊娠的机会较大，但这些二次葡萄胎者恶变率与初次葡萄胎者没有差异。本研究结果也提示葡萄胎恶变与ABO血型无关。
EGFR表达降低可能促进GTD的恶性进展，EGFR蛋白水平的改变先于病理形态的改变，在葡萄胎恶变的监测中具有更高的敏感性，EGFR可能可以作为早期诊断葡萄胎恶变的指标之一，从而为葡萄胎的预防性化疗提供依据。
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