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【摘要】 目的 探讨家蝇Attacin mRNA在幼虫各个时期的表达，为进一步研究家蝇的免疫防御打下基础。 方法 对家蝇三龄幼虫进行诱导，分别取诱导前0h和诱导后2h、4h、8h、12h、16h、24h、36h、48h的家蝇mRNA，进行RT-PCR，分析attacin基因在家蝇体内的时间表达模式。 结果 家蝇三龄幼虫体内的attacin基因在诱导前后均有表达，诱导后表达增强16 h达到相对高水平，维持约24h，而后开始下降。 结论 Attacin基因在家蝇三龄幼虫中是组成性表达，对进一步了解其在家蝇免疫系统，丰富对昆虫天然免疫的认识具有积极作用。
【关键词】 家蝇幼虫 attacin基因 半定量RT-PCR 表达模式
Expression pattern of Attacin genes in larvae of Musca domestica.
WANG Yan, JIN Xiao-bao, ZHU Jia-yong.
(Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, Guangdong, P. R. China)
Abstract：Objective To explore the expression pattern of Attacin genes encoding in larva of Musca domestica for further studying of innate immunity. Methods The expression pattern of total RNA extracted from the unchallenged was analyzed and challenged third instar larva 2h, 4h, 8h, 12h, 16h, 24h, 36h, 48h after challenge respectively for determineating the level of Attacin gene by using semi-quantitative RT-PCR. Results The results demonstrated that transcripts of the Attacin gene were detected in challenged and unchallenged larvae, distinctly reduced at 16h,maintained to 24h ,then decreased slowly. Conclusion Attacin gene has been expressed in the third instar larvae and it is of certain significance for further understand the immune system of Musca domestica.
Key words：Larva of Musca domestica; Attacin gene; Semi-quantitative RT-PCR; Expression pattern
蝇类在长期的进化过程中形成了独特的免疫防御机制。研究表明，蝇类免疫系统包括细胞免疫和体液免疫，两者相互协同对抗各种微生物的入侵，控制感染。体液免疫包括细菌识别蛋白、抗菌多肽、丝氨酸蛋白酶、蛋白酶抑制剂、酚氧化作用等［1～3］，其中抗菌肽在体液免疫中起着重要的作用。到目前已分离和鉴定的蝇类抗菌肽有十余种，其中家蝇中发现4种(本实验室最近克隆出来一种)，但其在免疫防御方面的机制还有待进一步明确。我们通过研究其表达模式，为进一步揭示家蝇免疫防御机制打下基础。
1 材料与方法
1.1 家蝇幼虫由广东省疾病控制中心提供。
1.2 诱导 用革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌）振荡培养，调整其浓度至OD60=1.0，等体积混合后备当天诱导用。用微量注射器，吸取少量诱导菌液，轻刺家蝇三龄幼虫后腹部，记录时间，继以100：1：200的麦麸，奶粉，水混合喂之。
1.3 RNA提取 提取步骤参见Trizol Reagent(Invitrogen)使用说明。利用紫外分光仪测定A260、A280 时RNA 的浓度,以及蛋白质含量。RNA电泳,凝胶成像系统照相。
1.4 RT-PCR 逆转录反应总体积25μl ,总RNA 1μg,Oligo dT (18)1μg混合后在70℃水浴变性5min迅速冰浴以破坏二级结构。然后加入10mmol/ L dNTP 1.25μl ，promega M-MLV 200U，M-MLV buffer 5μl，50U/μl RNasin 0.5μl ，42℃反应60min后，70℃温浴10min冰浴终止。
PCR 采用双重引物扩增技术,与待检测序列同时扩增,设计引物239 bp Attacin ：上游 5’-AACAGATAACTTTGGGTCG-3’下游: 5’-TAGCTTTGCCGGTAACAT-3’，内参照GAPDH (磷酸甘油醛脱氢酶)337bp：上游5’-CATCATCTCCGCTCCATC-3’，下游：5’-AAGCCATACCAGTGAGTTTACC-3’（均由上海生工合成），PCR反应总体积25μl中含1.25μl反转录产物,dNTP(10mmol/l)2.0μl,Ex Taq DNA 聚合酶0.125μl,Mgcl2 2μl,0.5μmol/ L引物,反应条件为94℃预变性2min,94℃变性30s,51℃退火30s，72℃延伸1min，72℃ 10min,循环数为32。取5μl PCR 产物与1μl加样缓冲液混合,1.2%琼脂糖凝胶，80V电压电泳。使用Quantility one凝胶成像系统进行分析，以了解Md-attacin基因经诱导前后表达量的时间变化规律。
2 结果
2.1 总RNA提取 提取诱导前和诱导后2h、4h、8h、12h、16h、24h、36h、48h家蝇三龄幼虫总RNA。如图1,总RNA 的28S、18S 2条带清晰可见,且28S 和18S 比值约为2:1,A260/A280比值在1.7～1.9之间。表明所提RNA纯度高,可作为反转录反应的模板。
2.2 RT- PCR 结果 家蝇幼虫Attacin基因在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌诱导后的表达和表达水平见图2～3。
图1 家蝇幼虫总RNA 电泳图谱（略）
从左至右分别为诱导前0h和诱导后2h、4h、8h、12h、16h、24h、36h及48h
Fig 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from larva of Musca domestica
Unchallenged; 2h after challenged，4h after challenged，8h after challenged，12h after challenged，16h after challenged，24h after challenged，36h after challenged，48h after challenged
图2 家蝇幼虫Attacin基因在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌诱导后的表达水平（略）
M为标准分子量;1～8分别为诱导前0h和诱导后2h、4h、8h、12h、16h、24h及36h表达;9：诱导后48h，质粒pmd-18-attacin， P：阳性对照，N：阴性对照
Fig 2 The expression level of Attacin from larva of Musca domestica challenged with mixtures of E.coli and S.aureus
M：DL 2000 DNA Marker 1: Unchallenged,2: 2 h after challenged, 3: 4 h after challenged ,4: 8 h after challenged,5: 12 h after challenged, 6: 16 h after challenged ,7: 24 h after challenged,8: 36 h after challenged,9: 48h after challenged ,P:positive control(pMD-18-attacin),N: negative control
图3 家蝇幼虫Attacin基因在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌诱导后的表达水平（略）
1～9分别为诱导前和诱导后2h、4h、8h、12h、16h、24h、36h及48h的表达水平
Fig 3 The expression level of Attacin from Musca domestica larva challenged with mixtures of E.coli and S.aureus
1: Unchallenged,2: 2 h after challenged, 3: 4 h after challenged ,4: 8 h after challenged,5: 12 h after challenged, 6: 16 h after challenged ,7: 24 h after challenged,8: 36 h after challenged,9: 48h after challenged
对上述的总RNA进行反转录成cDNA后，进行RT-PCR分析。如图2所示扩增出来的内参GAPDH基因条带清晰，各个时间点的亮度相近，大小与理论的337bp大小一致，阴性对照无条带。以诱导后12h、16h、24h、36h cDNA为模版扩增MD-attacin基因条带较清晰，大小和阳性对照一致，大约在239bp,48h表达量开始下降，在诱导前和诱导后2h、4h、8h条带不明显，所有亮度均低于内参基因。通过Quantility one凝胶成像分析系统,对胶进行扫描分析。结果显示在诱导前后MD-attacin基因均有表达，16h达到相对最高峰，随后表达开始下降，约有24h维持在较高的水平。总之，家蝇诱导前后都有MD-attacin基因表达，但在受到微生物诱导后表达明显增强，其表达量低于GAPDH基因。
3 讨论
3.1 有关半定量RT-PCR 本实验采用半定量RT-PCR 法检测了attacin mRNA 在诱导后的三龄幼虫的时间分布情况。由于家蝇幼虫体内富含较多的脂肪组织和蛋白质，且RNase含量高，本实验中采用Trizol Reagent(Invitrogen)试剂盒，通过适当增加Trizol、氯仿、异丙醇用量和作用时间，保持低温操作等，得到了完整性和均一性较好的总RNA。与经典的检测基因表达方法如Northern 印迹、RNA酶保护分析等相比,半定量RT-PCR 方法灵敏、专一性好、简便快速、且对初始总RNA量要求不是很严格,不需要已知浓度的标准品等优点,而得到广泛的应用。在本实验中，PCR 循环数为32次,这样可尽量将PCR产量控制在指数增长的阶段内，以保证未达到平台期.同时对模板量，引物浓度进行了摸索，结果在反转录产物1.25μl，引物0.5μl条带清晰。在本实验中,内标选用在各种组织或细胞均高效表达的基因(看家基因, House-keeping gene),设计引物时用BLAST系统进行相似性比较特异性强，上下游引物尽可能分属不同外显子,避免可能的基因组DNA 污染的影响。
3.2 有关mRNA的组织分布 抗菌肽在昆虫体内广泛存在，其中到目前为止果蝇体内发现8种抗菌肽，参与体液免疫。Attacin蛋白在生物体内广泛存在［1］。家蝇Attacin基因在诱导前后均有表达，在受到微生物诱导后表达增强，16h达到相对高峰，维持约24h之后开始下降,其表达量低于GAPDH基因。家蝇Attacin基因在未作诱导时表达量低，诱导后表达量逐渐增加，到16h达到相对高峰后开始下降。家蝇受到外界刺激后，抗菌肽表达量提高使免疫防御加强［2］。蝇类天然免疫的过程被认为有Toll、Imd、JAK/STAT三种复杂的信号通路。其中Toll和Imd途径在抗微生物肽的产生、激活三种NF-κB样因子（Dorsal，Dif，Relish），激发天然免疫反应中起着关键的作用［3～5］但是这些抗菌肽在遭受后的免疫应答机制还不是很清楚。现在较多的观点是昆虫抗菌肽的产生，是在外界因素诱导下发生的生物效应。这些诱导因子既可以是致病性的细菌，也可以是一些不造成感染的物理和化学的因素，如超声波、射线、生理盐水、聚肌胞核苷酸等［6］。但是抗菌肽的产生仅仅是靠诱导，本身在自然状态下是不是存在表达?梁永利等提到家蝇天蚕素诱导前无表达，在诱导后5h达到高峰［7］，而本基因却在16h达到高峰，有延迟效应。值得疑问的是为什么一些抗菌肽在未诱导状态下就存在，而一些受到诱导后才有表达；在诱导后，不同抗菌肽基因为什么在不同一时间内得到高表达？可能和诱导因素有关，不同的诱导条件，启动不同的信号通道产生作用。刺激不同的抗菌肽基因表达例如发生真菌或革兰氏阳性菌感染时，Toll借助它的TIR域与细胞浆内两种蛋白DmMyD88和Tube间相互作用将信号传入细胞内等。抗菌肽存在抗菌肽组成型表达和诱导型表达［8］，哪些负责“日常事务”，而哪些在受到外界损伤时才表达，以及在免疫防御方面的机制有待进一步明确。
此外，诱导过的家蝇和同期（同时孵化，同等饲养条件）未做诱导的对照组作比较，48h诱导组的家蝇80%左右已经成蛹,96h都已成蛹，相比较未诱导组的幼虫48h仍未成蛹（夏秋季节家蝇的幼虫期4～7d）。结果发现诱导促进了家蝇成蛹，考虑抗菌肽产生一方面抵御外界侵害起到免疫防御作用，另一方面可能促进机体发育提早进入蛹期来保护自己。但是相关的机制还有待进一步明确。
【参考文献】
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［6］ 王荫长．昆虫生物化学［M］.北京：中国农业出版社，2000，270～274.
［7］ 梁永利，赵小凡，王金星.家蝇防御素基因在家蝇幼虫体内的表达模式［J］.中国科技论文在线（http://www.paper.edu.cn）,2005,06:24.
［8］ Bullet P,Stocklin R,Menin L. Anti-microbial peptides:from invertebrates tovertebrates［J］. Immunol Rev,2004,198:169～184.
作者单位：广东药学院基础学院病原生物学研究室，广东 广州 510006.