槐耳浸膏对骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响

【摘要】  　　目的 探讨槐耳浸膏对骨髓瘤细胞株PRMI8226细胞增殖和凋亡的影响。 方法 取PRMI8226细胞与1.5mg/ml、3mg/ml、5mg/ml的不同浓度槐耳浸膏在体外孵育, 分别在24h、36h、和48h时用CCK-8法检测细胞增殖抑制率,并用流式细胞术(FCM )检测早期细胞凋亡情况。 结果 槐耳浸膏可抑制PRMI8226细胞增殖, 不同浓度的槐耳浸膏对多发性骨髓瘤细胞增殖的抑制效果不同,以5mg/ml抑制增殖效果最好。且浓度为5.0mg/ml的金克诱导多发性骨髓瘤细胞48h抑制率达到高峰84%。FCM检测表明槐耳浸膏可诱导PRMI8226细胞早期凋亡,用5.0mg/ml槐耳浸膏处理48h后，可引起25.9%的PRMI8226细胞凋亡。这两种作用均随槐耳浸膏浓度和作用时间的延长而增强。 结论 槐耳浸膏可在体外抑制PRMI8226细胞增殖, 并促进其凋亡。

【关键词】  多发性骨髓瘤 槐耳浸膏 细胞增殖 细胞凋亡

　　Impact of Huaierjingao on the proliferation and apoptosis of myoloma cell induced by PS-T.

　　QIAN Hong-lan, HU Qian, HU Xu-dong, et al.

　　(The First Affiliatd Hospital of Wenzhou Meidcal College, Hangzhou 325000, Zhejiang, P. R. China)
   
　　Abstract：Objective  To investigate the effects of Huaierjingao (PS-T) on proliferation and apoptosis of myeloma cell line PRMI8226 in vitro.  Methods  PRMI8226 cells were cultured with different concentrations of  PS-T (1.5, 3.0 and 5.0mg/ml). The inhibition of proliferation was measured by CCK-8 assay 24, 36 and 48 hours after culture and cell apoptosis was evaluated by flow cytometry.  Results  PS-T inhibited the growth of PRMI8226 cells in concentration and time-dependent manner. Flow cytometry analysis showed that PS-T induced apoptosis of PRMI8226 cells, and the percentage of apoptotic cells increased as the concentration increased and time elongated.  Conclusion  PS-T can inhibit proliferation of PRMI8226 cells and promote its apoptosis.
   
　　Key words：: Myeloma; PS-T; Proliferation;  Apoptosis

　　槐耳是一种入药1 500余年但已湮没300余年的重要药用真菌，它和其原料药材槐耳菌质近年来已被批准为国家一类新药。其成品(金克R-槐耳颗粒国家一类新药) 目前已用于临床,对肝癌、肺癌、食管癌、胃癌、淋巴瘤等均有独特疗效［1～5］。为进一步探讨其抗癌机制，本实验以多发性骨髓瘤细胞株PRMI8226细胞为研究对象，观察槐耳浸膏对PRMI8226细胞株增殖及凋亡的影响, 为临床应用槐耳颗粒治疗多发性骨髓瘤提供理论依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  药物与试剂  槐耳浸膏由江苏盖天力药业有限公司提供, CellCountingKit-8试剂（日本同仁化学研究所），FITC-Annexin-V试剂（Bender Medsystems公司）,PRMI-1640培养基（美国GIBCO公司,胎牛血清(天津市正江高科技有限公司)。

　　1.2  细胞  多发性骨髓瘤细胞株PRMI8226,由浙医大惠赠。

　　1.3  仪器  FACSC calibur流式细胞仪(美国B. D公司),酶标仪（Bio-tek Instruments ELX800)。

　　1.4  实验方法

　　1.4.1  药品制备  精确称取槐耳浸膏1 000mg(由江苏盖天力药业有限公司提供) ,将其溶解于100mlPRMI-1640培养基,以0.22μm超滤除菌器过滤除菌,制备成10mg/ml的PRMI-1640浓缩含药培养液,实验时稀释成不同浓度备用。

　　1.4.2  细胞培养  多发性骨髓瘤细胞株PRMI8226用常规方法培养。培养条件为加1%青霉素、1%链霉素、10%小牛血清的PRMI - 1640培养液,相对湿度94%,5%CO2 ,37℃。细胞每隔48～72h换液1次, 细胞浓度2×105/ ml常规传代培养。

　　1.4.3  CCK-8法检测细胞增殖活性  实验按CCK-8试剂盒说明书操作,主要包括取对数生长期细胞,将每孔6×103个PRMI8226细胞接种于96孔培养板中,24h后于96孔培养板分别加入0、1.5、3.0、5.0mg/ml的槐耳浸膏,每组6复孔,继续培养24h、36h、48h后,每孔加入CCK-8溶液10μl,微振荡后37℃继续孵育1～2h,酶标仪测OD 450nm值。生长抑制率计算公式:生长抑制率(%)=(1-实验组平均吸光度/细胞对照组平均吸光度)×100%。

　　1.4.4  流式细胞术检测细胞凋亡  用AnnexinV/PI方法检测细胞凋亡,检测方法参照试剂盒说明书进行。设立1个对照组和3个药物浓度组,每组浓度分别为0、1.5、3.0和5.0mg/ml。不同浓度药物与PRMI8226细胞共同培养48h,每组收集1×106个细胞;将细胞悬于1:4稀释（50ml buffer +150ml蒸馏水）的binding buffer液中,重悬细胞，并调整细胞流式细胞仪检测细胞敏感浓度 2-×105/ml，取195μl细胞悬液加入5μl BTV-HbC3上机检测在24h、36h、48h时的凋亡百分率。

　　1.5  统计学方法  采用SPSS11.0软件。所有数据以x±s表示。组内比较采用单因素方差分析和t检验。组间比较采用双因素可重复数据方差分析。

　　2  结果

　　2.1  PRMI8226细胞增殖抑制情况  图1所示槐耳浸膏对PRMI8226细胞的增殖具有明显的抑制作用。5.0、3.0、1.5mg/ml槐耳浸膏对PRMI8226细胞作用48h时生长的抑制率分别为84.3%、67.9%、25.8%，并且随着槐耳浸膏浓度的增加和作用时间的延长, 其对PRMI8226细胞的增殖抑制率逐渐增高,除24h外，同一时间不同浓度各组比较(P<0.01)，除1.5mg/ml外，同一浓度不同作用时间各组比较(P<0.01)。见图1和图2。

　　图1  槐耳对PRMI8226细胞的增殖抑制率（略）

　　图2  槐耳对PRMI8226细胞凋亡率影响（略）

　　2.2  PRMI8226细胞凋亡情况  AnnexinV-FITC/ PI双染色后经流式细胞仪行细胞凋亡计数, PRMI8226细胞经1.5～5.0mg/ml槐耳浸膏作用24～48h后,细胞凋亡结果显示1.5～5.0mg/ml槐耳浸膏在一定时间范围内, 诱导PRMI8226细胞的作用随药物浓度及作用时间的增加而增强, 呈明显的时间和浓度依赖性, 除24h外，同一浓度不同作用时间各组比较(P<0.001)，同一时间不同浓度各组比较(P<0.01)，见图2。

　　3  讨论
   
　　多发性骨髓瘤是影响人类健康的恶性肿瘤之一，由于对化疗药物易产生耐药性,故临床治疗效果并不理想，因此,需要探寻新的治疗药物及治疗手段。多发性骨髓瘤既与细胞增殖过度有关，又与细胞的凋亡不足有关。本实验就是从细胞增殖和凋亡的角度着手，研究槐耳对骨髓瘤细胞株PRMI8226细胞增殖和凋亡的影响，旨在阐明其可能的作用机制。
   
　　槐耳浸膏是一种新型真菌类抗肿瘤新药,由槐耳菌质经热水提取所得,含有多种有机成分和18种以上矿物质,其主要抗癌活性成分为蛋白多糖(PS-T)［6,7］。不仅能抑制肿瘤细胞的生长,促进肿瘤细胞凋亡,还可增强机体免疫力,是一种较理想的免疫增强及肿瘤抑制剂。同时，其对血管的内皮细胞构建新生血管具有抑制作用，从而可抑制肿瘤血管的生成［8,9］。因此它是一类不可多得的抗肿瘤新药。本实验探讨槐耳对骨髓瘤细胞株增殖抑制和诱导凋亡，为其应用于多发性骨髓瘤的临床治疗提供实验依据。
   
　　从细胞增殖的角度着手，本研究采用CCK-8法观察了槐耳浸膏抑制PRMI8226细胞增殖的作用, 发现5.0mg/ml的槐耳浸膏能抑制细胞的增殖，48h的抑制率高达84%。且槐耳浓度越高作用时间越长,抑制增殖效果越明显,提示槐耳浸膏对骨髓瘤细胞株PRMI8226细胞的抑制作用存在明显的时间和剂量效应关系。本实验中发现不同浓度药物在短时间内(24h)时,该药不仅没有抑制作用，反而呈现促进增殖的异常作用,因此我们仍需进一步研究药物在短时间的作用机制。且低浓度时（1.5mg/ml）该药抑制细胞增殖作用随时间的延长不增强，可能与药物浓度过低有关。流式细胞术检测还发现槐耳浸膏具有诱导RMI8226细胞凋亡的能力, 并且随着槐耳浸膏浓度的升高和时间的延长, 槐耳浸膏细胞发生凋亡的比率也随之增加, 浓度为5.0mg/ml槐耳浸膏对PRMI8226细胞处理48h引起22.59%的凋亡率。
   
　　综上所述, 槐耳浸膏可以抑制骨髓瘤细胞株PRMI8226细胞的体外增殖并诱导其凋亡, 因此有希望成为治疗骨髓瘤的新药物。

【参考文献】
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作者单位：温州医学院附属第一医院血液科，浙江 温州 325000.