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【摘要】 目的 探讨HBV 前C区基因用于乙型病毒性肝炎早期诊断价值和意义并基于此靶基因制备荧光定量PCR标准曲线。 方法 设计特异性引物，将pBR322-HBV 质粒前C区部分序列PCR 产物AT亚克隆至pBS-T载体，提取和纯化质粒DNA，制作标准品并在FQ-PCR仪上得到标准曲线，进而对精确度和重复性进行统计分析。 结果 获得了预期希望的质粒。荧光定量PCR标准曲线的相关系数为0.995，线性范围5×103 copies/μl ～5×109 copies/μl。批内、批间变异系数值均小于5%，精确度高，重复性好。 结论 HBV前C区基因用于乙型病毒性肝炎早期检测和诊断有一定价值和意义。且FQ-PCR 标准曲线的成功制备，临床早期检测乙肝病毒感染奠定了基础。
【关键词】 乙型肝炎病毒 前C区基因 亚克隆 荧光定量PCR 标准曲线
Subcloning of partial sequence of gene of HBV pre-C region and preparation of standard curve for real-time flujorescence quantitiative PCR.
YUAN Yuan, CHEN Qiang, YANG Ji-hong, et al.
(Life Science College of Central China Normal University, Wuhan 430079, Hubei, P. R. China)
Abstract：Objective To explore the significance and value of HBV pre-c region genes used in the early diagnosis of hepatitis B. Methods The partial gene sequence of HBV pre-c region in pBR322-HBV was amplified by PCR. The products amplified by PCR were sub-cloned into the pBS-T vector. They were an effective AT clone plasmid. The positive AT sub-clones were sequenced. Standard products were made and standard curve was obtained from real-time fluorescence quantitative PCR. Accuracy and repeatability were analyzed. Results The expected plasmid with HBV pre-c region gene was harvested. The correlation coefficient of standard curve for real-time fluorescence quantitative PCR was 0.995. The linear range was from 5×103 copies/μl to 5×109 copies/μl. All the coefficient of variation within batch and between batch were smaller than 5%. Both precision and repeatability were good. Conclusion HBV pre-c region genes to be used in the early detection of Hepatitis B are prospective. Standard curve of real-time fluorescence quantitative PCR for hepatitis B has been successfully made in this paper. Finding of this research has set a very good fundation for real-time fluorescence quantitative PCR applied in the field of clinical detection of hepatitis B.
Key words：HBV; Gene of pre-c; Dub-clone; Real-time fluorescence quantitative PCR(FQ-PCR); Standard curve
目前常用于检测乙型肝炎病毒的ELISA技术，灵敏度不高，不宜用于乙型肝炎病治疗效果评价。常规PCR技术检测HBV-DNA，虽然具有很高的灵敏度，但只是定性检测，对乙型肝炎病毒感染不能作定量检测。荧光定量PCR技术可克服上述不足，可检测HBV-DNA的拷贝数。本文通过研究HBV前C区基因，建立荧光定量PCR标准曲线，旨在为乙型肝炎病毒感染的早期检测提供定量检测手段。现将研究结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料 pBR322-HBV 质粒由本院微生物实验室保存; DH5α菌种由本实验室保存；PCR引物是利用引物和探针设计软件Primer Express2.0［1］(AB Biosystems 产品)设计,由基康公司合成; pBS-T连接试剂盒、50bp 分子量标准购自北京天为时代有限公司；Taq DNA 聚合酶购自武汉天源公司(产自Canada) ；X-gal、IPTG购自Sigma公司；3S Spin Plasmid Miniprep Kit V3.1质粒小抽试剂盒、dNTP购自上海申能博彩有限公司；其余常规试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 引物和TaqMan探针设计 用Primer Express2.0 软件对HBV ayw（Genebank序列号：DQ486024）前C区保守序列设计特异性引物，引物序列和位置如下：
正向引物(2622-2640)YB-1: 5’-GAGTTGGATTCGCACTCCT-3’
反向引物(2716-2734)YB-2: 5’-ATGGTGGATTCGCACTCCT-3’
TaqMan探针（2672-2700）YT-1：
5’FAM-CCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCC-3’TAMRA
1.2.2 PCR扩增pBR322-HBV前C区基因 前C区目的基因扩增的反应体系为：0.2mmol/L dNTP, 1.5mmol/L MgCl2, 0.4mmol/L正向引物, 0.4mmol/L 反向引物, 0.02U/μl Taq DNA聚合酶，模板2μl，1×反应缓冲液；补水至总体积50μl，在Bio-Rad PTC-200 PCR仪上94℃ 10min， 94℃ 10s，60℃ 30s，循环45次。
1.2.3 感受态细胞的制备 用CaCl2制备感受态大肠杆菌［2］。
1.2.4 AT亚克隆［3］ （1） 连接 电泳检测PCR产物，对照Marker估算DNA浓度，将剩余PCR产物无需纯化，直接使用pBS-T连接试剂盒进行连接，体系为：10×T4 DNA Ligation Buffer 1μl, pBS-T载体1μl（50ng），T4 DNA Ligase 1μl (3U), PCR 产物0.3μl（约5ng），dd H2O 6.7μl，16℃连接16h。（2）转化 取5μl连接液至100μl感受态细胞中轻轻旋转几次混匀，冰浴30min，42℃静止热激90s，快速冰浴2min，加入400μl SOC培养基，用水浴将培养基加温至37℃，转移至37℃摇床(转速小于225rpm/min)，温浴45min, 取200μl均匀涂布于90mm LB平板上（平板含Amp终浓度为60μg/ml，均匀涂布40μl X-gal 和16μl IPTG 混合物），待接种液完全吸收后，颠倒培养板于37℃培养16h。（3）菌落PCR［4］初步鉴定与测序 挑取白色菌落接种于新鲜含有60μg/ml Amp的5ml 液体LB培养基中37℃， 250rpm/min振荡培养，同时也将菌落做模板在1.2.2所述PCR反应体系和条件下扩增，初步鉴定阳性亚克隆。将鉴定为阳性克隆子的菌液送Invitrogen 公司测序。
1.2.5 HBV-DNA荧光定量PCR定量DNA标准的制备 （1）质粒的提取和纯化:测序结果验证为阳性亚克隆的菌液接种于新鲜含有60μg/ml Amp LB液体培养基中,37℃，225rpm/min培养箱中振荡培养16h（菌液体积：LB液体培养基体积为1：100），用3S Spin Plasmid Miniprep Kit V3.1质粒小抽试剂盒提取和纯化质粒DNA。（2）质粒浓度测定:用紫外分光光度计测出前C区质粒浓度为60μg/ml（A260/A280=1.85），计算其摩尔质量（69μg/ml ×10-6）/（3113×666），再与阿佛加德罗常数6.02×1023相乘，计算出每质粒的拷贝数为2.00×1010 copies/μl。（3）质粒倍比稀释［5］:取100μl 2.00×1010copies/μl质粒用TE稀释至400μl，浓度为5×109copies/μl ，再取100μl 5×109copies/μl质粒至900μl TE中，浓度为5×108copies/μl ，依此类推，共稀释10个梯度，直到5copies/μl。
1.2.6 荧光定量PCR标准曲线的制备 在BioRad PTC-200 chromo4荧光定量PCR仪上对5copies/μl～5×109copies/μl浓度的质粒标准品为模板进行扩增。荧光定量PCR反应体系为10×PCR 缓冲液（带1.5mmol/L Mg2+）5μl，10mM dNTP 1μl，20μΜ YB-1、YB-2各1μl，TaqMan探针1μl，Taq 酶0.5μl （2U/μl），质粒2μl，灭菌双蒸水补足至50μl。反应条件为94℃ 3min，plate read,94℃ 10s，60℃ 1min,plate read，循环45次。得到荧光扩增曲线和标准曲线。
1.2.7 HBV-DNA荧光定量PCR精确度测定 即测批内变异系数，一个样品同时做出10个CT，求CV 。
1.2.8 HBV-DNA荧光定量PCR重复性测定 即测批间变异系数，5～10个样品重复做4次CT，求CV 。
2 结果
2.1 从pBR322-HBV 质粒扩增前C区目的片段 以pBR322-HBV质粒为模板在ABI 9700 PCR仪上扩增，产物在2%琼脂糖凝胶电泳，GeneSnap 凝胶成像系统中成像（图1）。扩增产物大小为113bp，得到预期HBV前C区片段。
图1 HBV前C区基因扩增结果（略）
1：50bp DNA分子量标准；2：阴性对照；3：目的片段
2.2 阳性亚克隆的初步鉴定 将白斑做菌落PCR，扩增条件与1.2.2相同，初步鉴定阳性亚克隆子，电泳结果见图2。
图2 菌落PCR产物电泳图（略）
1:50bp 分子量标准；2：阴性对照；3～8：阳性亚克隆菌落PCR产物
2.3 测序结果 将前C区基因菌落PCR检测为阳性亚克隆菌液，送往Invitrogen 公司，用377测序仪测序（图3）。结果鉴定HBV 前C区基因部分序列已亚克隆到pBS-T载体。序列为5’-GAGTTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTCGTCGTCTAACAACAG TAGTCTCCGGAAGTGTTGATAGGATAGGGGCATTTGGTGGTCTATAA GCTGGAGGAGTGCGAATCCACCAT-3’。长度113bp，在NCBI上BLAST特异性分析，与已知人DNA序列和其他病毒无相似性，证明此序列特异性高。同时，此序列在已测序的HBV序列中均能找到完全互补的部分，保守性强，因此将其作为检测HBV的靶序列。
图3 HBV前C区部分序列测序结果（略）
2.4 荧光扩增曲线及标准曲线 取带有HBV前C区基因的pBS-T质粒标准品5×109、5×108、5×107、5×106、 5×105、 5×104、 5×103、500、50、5（单位：copies/μl） 在Bio-Rad chromo4荧光定量PCR仪上进行FQ-PCR 检测，从图4可见，本方法检测的敏感性达到5×103copies/μl。
标准曲线的回归方程：y=-0.29x+13.60，相关系数为0.995，此结果表明，在5×103～5×109拷贝范围之间，样本拷贝数与其相应的Ct值具有良好的相关性，因此，本标准品可对5×103～5×109拷贝范围内的模板进行准确定量。
图4 不同浓度质粒标准品的荧光扩增曲线（略）
1～7: 质粒拷贝数分别为5×109,5×108, 5×107, 5×106, 5×105, 5×104, 5×103(单位： copies/μl)的扩增曲线
2.5 精确度测定 将5×106copies/μl的pBS-T质粒标准品平行10个同时在同等条件下进行荧光定量PCR，得出Ct值分别为：24.074，23.899，24.507，25.496，25.034，24.899，24.724，25.246，26.201，25.520，平均Ct值为24.960，样本标准差SD为0.699，变异系数CV（%）为2.800%，CV值小于5%表明本方法检测的精确度高。
2.6 重复性测定 将不同拷贝数的pBS-T质粒标准品5×104, 5×105, 5×106, 5×107, 5×108 (单位：copies/μl)重复测定4次，将4次的实验结果进行统计分析，从而对重复性进行考核。实验结果见表1。
对上述结果的统计分析表明，5种不同浓度的质粒标准品重复4次实验结果变异系数CV值均小于5%。本方法检测的重复性良好。
表1 荧光定量PCR精确度的测定（略）
3 讨论
随着分子病毒遗传学的发展而建立起来的PCR技术已成为病毒等病原性疾病灵敏的检测手段。自1999年初以来，美国对所有采集的血液都进行了核酸扩增检测（NAT）［6］，主要检测HIV-1和HCV，也用于检测HBV［7］。随着对基因序列分析精确要求的提高，应用荧光定量PCR更能够准确、特异、敏感地对靶序列模板进行定量分析。该技术整个实验过程均在完全闭管的状态下进行, 无需PCR 后处理和冗长的电泳、紫外或染色检测, 解决了常规PCR 实验不能准确定量及扩增产物污染而导致的假阳性, 操作繁复以及强烈致癌物溴化乙啶对作人员的危害和污染环境等问题,可成为常规PCR 的更新换代技术。
以pBR322为载体的拷贝数仅为15～20个［8］，而以高效克隆的pBS-T为载体，其目的基因拷贝数可等同pUC19载体，高达500～700个，将目的基因的拷贝数提高约40倍，有效解决了标准品制备的来源问题。同时，基于引物和探针设计软件Primer Express2.0对靶序列长度的要求，检测的片段选择了HBV的前C区保守部位，该片段113bp，亚克隆步骤中勿需纯化PCR产物就可直接连接至pBS-T载体。节省了时间和简化了操作步骤。
在荧光定量PCR绝对定量标准曲线的制备中，通过对标准曲线的线性范围和相关系数的确定，得到灵敏度指标，同时对精确度、重复性的统计分析，说明本方法的准确度和可信度较高，为检测实际临床样本奠定基础，为血液筛查、临床应用提供依据。
不可否认，FQ-PCR比目前临床上广泛使用的ELISA、常规PCR等方法需要更多的财力，还没有普遍用于流行病和临床，但基于该项技术的不断成熟和成本的降低，相信在某一天可成为常规早期检测方法。
【参考文献】
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作者单位：华中师范大学生命科学学院,湖北 武汉 430079.