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【摘要】 目的 研究海南黎汉族高血压人群ACE基因多态性及危险因素的关系。 方法 采用聚合酶链反应（PCR）方法，对海南黎族111例高血压患者、146例黎族正常人和海南汉族106例高血压患者、97例汉族正常人的ACE基因插入/缺失（I/D）多态性检测，观察DD、DI、II基因型频率及等位频率，并对所有普通PCR定为DD型的样本进行插入特异性PCR检测，以减少误分型率，并分析高血压患者经典危险因素。 结果 海南黎族高血压组与正常对照组比较，DD、DI、II基因频率及D、I等位基因频率均无显著性差异。海南汉族高血压组与正常对照组比较，DD、DI、II基因频率及D、I等位基因频率均差异有显著性（P<0.05）。ACE基因型分布与黎族、汉族高血压患者的年龄、性别、体重指数（BMI）、收缩压、舒张压、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL - C）、高密度脂蛋白（HDL - C）、载脂蛋白A（ApoA）、载脂蛋白B（ApoB）差异均无显著性（P<0.05）。 结论 ACE基因I/D多态性与黎族高血压无显著关联；ACE基因I/D多态性与汉族高血压有显著关联，是汉族高血压的主要致病基因；ACE基因型分布与黎族、汉族高血压经典危险因素无关，ACE缺失多态性是汉族高血压的独立危险因素。
【关键词】 高血压 ACE基因 多态性 危险因素
Study on the relationship between ACE gene polymorphismsand risk factors in hypertension patients of LI Nationality and Han Nationality in Hainan Province.
YUN Mei-ling，ZHONG Jiang-hua， JIN Shui-jing，et al.
(Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570102, Hainan, P. R. China)
Abstract：Objective To investigate the relatioship between ACE gene polymorphisms and risk factors in hypertension patients of LI Nationalit and Han Nationality in Hainan Province. Methods The polymorphisms of ACE gene insertion/deletion (I/D) in 111 patients with hypertension and 146 healthy people of Li Nationality in Hainan and 106 patients with hypertension and 97 healthy people of Han Nationality in Hainan were determined. The frequencies of genotype and allele of DD, DI and II were also determined. Furthermore, insertion-specific PCR was used to test all the subjects who’s DD genotype were determined by common PCR for confirmation Classical risk factors were also analyzed. Results There no significant differences both in genotype frequencies of DD, DI and II, and in allele frequencies of D and I between the hypertension patient Li Nationality and its healthy control were observed. But there were significant differences both in genotype frequencies of DD, DI and II, and in allele frequencies of D and I between the hypertension group ofHan Nationality and its healthy control （P<0.05）. There no significant differences between the distribution of ACE genotype and age, body mass index (BMI), systolic pressure, diastolic pressure, total serum cholesterol (TC), triglyceride (TG), LDL-C, HDL-C, ApoA or ApoB in hypertension patients of Li Nationality or Han Nationality (P<0.05). Conclusion There is no remarkable correlation between ACE gene I/D polymorphism and hypertension in Li Nationality, but I/D polymorphism of ACE gene is markedl correlated with hypertension patients of Han Nationality, and the I/D polymorphism of ACE gene is the major gene that causes hypertension in Han Nationality. The distribution of ACE genotype is no assoicated with classical risk factors of hypertension in Li and Han nationalities. The ACE deletion polymorphism is an independent risk factor for hypertension in Han Nationality.
Key words：Hypertension; ACE Gene; Polymorphism; Risk Factors
高血压病是一种由多种遗传和环境共同作用所致的复杂的多基因遗传病。血管紧张素转换酶（Angiotensin Converting enzyme, ACE）是肾素—血管紧张素系统的重要组成部分，在血管紧张素II的产生和缓激肽的降解中起关键作用，ACE基因则被认为是高血压的候选基因。近来的研究发现，ACE基因多态性与高血压风险有关。我们应用聚合酶链反应（PCR）检测，海南黎族、汉族高血压患者的ACE基因多态性频率，并检测高血压经典危险因素，旨在研究ACE基因多态性与黎族、汉族高血压危险因素的相关性。
1 对象与方法
1.1 研究对象 2005年4月～2006年12月，海南省昌江、陵水黎族自治县的黎族人群，祖籍为黎族且三代以上父母双方均为黎族，入选257人,其中高血压组111例,正常对照组146例。汉族入选203人，高血压病人为本院心血管内科住院病人106例，正常对照组海南省老人病医院健康体检97例。高血压诊断标准符合1999年WHO修订成人高血压分类标准，排除继发性高血压。经详细的病史询问、体格检查、身高、体重、血生化等检测。
1.2 高血压危险因子 参照WHO多国心血管趋势和决定因素监测（MONIA）方案［1］，详细记录每一病例的临床表现、辅助检查、生化检查结果及危险因素。高血压病经典危险因素按下述标准定义：1．体重指数（BMI）>24kg/m2者。按体重（Kg）/身高（m2）公式计算。2．高脂血症为血清胆固醇（TC）≥5.69mmol/L和甘油三酯（TG）≥1.69mmol/L，包括医疗记录既往有高脂血症者。
1.3 血样采取及血脂浓度测定 抽取清晨空腹静脉血8ml，其中4ml以125U肝素抗凝，用于抽提基因组DNA；余4ml血凝结后取血清测定血脂浓度。TC、TG用酶法，高密度脂蛋白（HDL）用磷酸镁沉淀法，载脂蛋白（ApoA）和（ApoB）采用免疫比浊法。低密度脂蛋白（LDL）浓度根据Friedwald公式计算(LDL=TG-HDL-TG/5)。
1.4 ACE基因多态性检测
1.4.1 研究方法 引物设计与合成：参照王谷亮［2］、江程澄［3］等报道稍有改动设计引物并委托合成引物。引物序列如下：
ACE-1:5’-CTG GAG AGC CAC TCC AAT CCT TTCT-3’
ACE-2:5’-TGG GAC CAC AGC GCC CGC CAT AC-3’
ACE-3:5’-TCG CCA GCC CTC CCA TGC CCA TAA -3’
ACE-1和ACE-3引物对扩增ACE基因中包括Alu插入片段的DNA区域，当样本是插入纯合子(Ⅱ型)时，PCR扩增将只出现一条533bp的DNA扩增片段，当样本是缺失纯合子(DD型)时，PCR扩增将只出现一条233bp的DNA扩增片段，当样本是插入缺失杂合子(DI型)时，PCR扩增将同时出现533bp和233bp两条DNA扩增片段；ACE-2引物是针对ACE基因中Alu插入片段设计的特异性扩增引物，当ACE-2和ACE-3引物对进行PCR扩增时，将可检验Alu插入片段存在与否，可进一步检验ACE-1和ACE-3引物对的PCR扩增基因分型结果的准确性，即当样本是插入纯合子(Ⅱ型)或插入缺失杂合子(DI型)时，将出现一条335bp的PCR扩增片段，当样本是缺失纯合子(DD型)时，将无PCR扩增片段。
1.4.2 PCR扩增 PCR反应体积为25μl，在PCR缓冲液（10mmol/L Tris-HCl,pH8.3,50mmol/L KCl,2.0mol/L MgCl2,0.01% Gelatin）中含模板DNA 0.2μg,引物0.2～0.5μmol/L，dNTP为200μmol/L,1U Taq DNA聚合酶（宝生物（大连）工程有限公司产品），置Tgradient 96 梯度PCR仪中扩增，94℃ 2min,94℃ 50Sec，65℃ 50Sec，72℃ 1min。重复循环32次，将扩增产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色在紫外光灯下观察结果。
1.4.3 统计学分析 应用SPSS13.0统计分析软件包进行资料分析。计算各组基因频率及等位基因频率，组间比较用卡方检验。性别、年龄、体重、血压、血脂水平比较用t检验。P<0.05为有显著统计学差异。
2 结果
2.1 高血压危险因素特征 黎族、汉族高血压组与正常对照组比较，在年龄、性别上无显著差异；黎族、汉族高血压组与正常对照组比较体重指数（BMI）差异有显著性（P＜0.05）黎族高血压组收缩压(155.8±18.4)mmHg，舒张压(91.2±12.3)mmHg，正常对照组收缩压(113.1±14.6)mmHg，舒张压(72.0±7.8)mmHg，两组之间收缩压、舒张压差异均有显著性（P<0.05）。汉族高血压组收缩压(155.4±15.3)mmHg、舒张压(101.2±15.2)mmHg、正常对照组收缩压(120.3±14.0)mmHg、舒张压(73.0±8.9)mmHg，两组之间收缩压、舒张压差异均有显著性（P<0.05）,见表1。
2.2 血脂分析 黎族、汉族高血压组在总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）上均高于对照组，差异有显著性（P<0.05）；而在高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、载脂蛋白A（ApoA）、载脂蛋白B（ApoB）则与对照组差异无显著性（P>0.05）。见表1。
表1 海南黎族、汉族正常对照组与高血压组一般资料比较（略）
注:*与正常对照组对比，P<0.05。
2.3 PCR扩增结果 经ACE-1和ACE-3引物对PCR反应,得到三种基因型: DD型(缺失纯合子,只出现233bp PCR扩增片段)，DI型(缺失/插入杂合子,同时出现233bp和533bp两种PCR扩增片段)，Ⅱ型(插入纯合子，只出现533bp PCR扩增片段)。用ACE-2和ACE-3引物对对插入序列Alu片段进行特异性扩增时，Ⅱ型和DI型可以扩增出一条335bp的DNA片段，而DD型则无PCR扩增片段。见图1。
图1 ACE基因PCR扩增基因分型结果（略）
M为100bp DNA Ladder(北京天为时代科技有限公司产品)，1-6为ACE-2和ACE-3引物对PCR扩增结果，其中1，2为Ⅱ型；3，4为DI型；5，6为DD型；7-12为ACE-1和ACE-3引物对PCR扩增结果，其中7，8为II型；9，10为DI型；11，12为DD型。
2.4 基因型频率及等位基因频率 海南黎族高血压组DD、DI、Ⅱ基因型频率分别为10.8%、37.8%、51.4%；D及I等位基因频率分别为29.7%、70.3%。黎族正常对照组DD、DI、Ⅱ基因型频率分别为13.0%、43.8%、43.2%；D及I等位基因频率分别为34.9%、65.1%。两组之间DD、DI、Ⅱ基因型频率及D、I等位基因频率差异均无显著性（P>0.05）；汉族高血压DD、DI、II基因频率为16.0%、28.3%、55.7%；D及I等位基因频率分别为30.2%、69.8%。汉族正常人DD、DI、II基因频率15.5%、44.3%、40.2%，D及I等位基因频率分别为37.6%、62.4%。两组之间DD、DI、II基因型频率及D、I等位基因频率差异有显著性（P<0.05）。见表2。
表2 海南黎族、汉族正常对照组与高血压组基因型和等位基因频率对比（略）
2.5 ACE基因多态性与高血压危险因素的关系 海南黎族、汉族高血压组ACE基因型与高血压危险因素比较如表3所示，可见ACE基因型和各危险因素之间差异无显著性（P>0.05）。
表3 在高血压组中ACE基因型与高血压经典危险因素的比较（略）
3 讨论
血管紧张素转换酶ACE是肾素—血管紧张素系统重要组成部分，血管紧张素I在ACE的作用下转化为血管紧张素Ⅱ，发挥强大的缩血管作用。随着对ACE研究不断深入，发现ACE基因位于17号染色体长臂第23区（17q23），由21kb的DNA组成，包括26个外显子和25个内含子，其中第16内含子存在一段287bp DNA片段的Alu插入/缺失（I/D）多态性［4］。进一步研究证明这种多态性与ACE水平密切相关，即血浆和组织ACE浓度和I/D多态性的D等位基因一致［5］。已经证实，高脂血症、高血压、肥胖是高血压的危险因素［6,7］。
ACE基因多态性与高血压关系存在着种族、民族或地区差异，白种人D等位基因频率高于I等位基因频率，黑人D等位基因频率高于I等位基因频率，并且其D等位基因频率比白种人的要高一些。但有这种差异的形成及原因尚需进一步研究［8］。在国内许多研究发现，同地区的人群ACE基因多态性分布不同［9］。Morris等研究发现老年高血压患者DD型检出率明显少于II型。Zee等亦认为II型与高血压有关［10］。Staessen-JA对1997年之前相关研究的Meta分析综合145篇报道49 959人表明：ACE基因DD型与高血压无关［11］。而此类研究中认为DD型与高血压相关研究在所阅读的文献中占比例较大，并且认为ACE基因DD型与严重级别高血压有关［12］。Swierblewska-E等研究表明DD型与动脉收缩相关，II型与动脉舒张压相关，ACE基因DD型与高血压病早期发生有关［9］。
海南有独特的气候环境、地理条件，黎族是海南特有的少数民族，有特殊的遗传背景。我们结果显示，黎族高血压、黎族正常人的D等位基因频率比I等位基因频率低，这与在日本、非洲、美国人群发现的D等位基因频率分布相似［13］。在美国黑人及日本人中研究发现ACE基因多态性与高血压有关联［14,15］，但在白种人研究中ACE基因多态性与高血压却无关联［16］。结果也显示，黎族高血压病人的D等位基因频率也较I等位基因频率低，黎族高血压与正常对照组间基因频率、等位基因频率分布比较均无显著统计学差异，提示ACE基因I/D多态性与黎族高血压无显著关联，不是黎族高血压的主要致病基因，而汉族高血压与正常对照组两组基因频率、等位基因频率分布比较均有显著统计学差异（P<0.05），提示ACE基因I/D多态性与汉族高血压显著关联，是汉族高血压的主要致病基因。对黎族、汉族高血压与对照组公认危险因子的检测发现，体重指数（MBI）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）较对照组显著升高（P<0.05），提示以上因子在高血压发病中仍起重要作用。而黎族、汉族高血压ACE基因型分布和各危险因素之间差异无显著性（P>0.05）。提示ACE缺失多态性是汉族高血压的危险因素，早期应用血管紧张素转换酶抑制剂（ACE I）、血管紧张素受体拮抗剂（ARB）治疗干预十分重要，为高血压防治提供新的策略。
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作者单位：海南医学院附属医院心内科,海南 海口 570102; 海南省老人病医院,海南 海口 571100； 海南医学院生化教研室,海南 海口 571101.