虫草多肽对小鼠免疫功能的影响

【摘要】  　　目的 研究虫草多肽对小鼠免疫功能的影响。 方法 分别以41.7、83.3、166.6mg/kg·BW剂量的虫草多肽给小鼠连续灌胃30d，测定各项免疫指标。 结果 虫草多肽能提高小鼠的抗体生成细胞数和血清溶血素水平，促进小鼠的单核－巨噬细胞碳廓清功能及腹腔巨噬细胞的吞噬能力。促进小鼠的迟发型变态反应，显著提高小鼠的NK细胞活性。 结论 虫草多肽具有增强小鼠免疫力功能。

【关键词】  虫草多肽 免疫功能 小鼠

　　Impact of Chongcaoduotai on the immune function of mice. 

　　LIANG Jian, HE Li, FU Wei-zhong, et al.

　　(Guangxi Zhuang Autonomous Region Center for Disease Control and Prevention, Nanning 530021, Guangxi, P. R. China)
   
　　Abstract：Objective  To explore the impact of Chongcaiduotai on the immune function of mice.  Methods  Chongcaoduotai at the doses of 41.7mg/kg, 83.3mg/kg and 166.6mg/kg body weight were orally given to mice for succession of 30 days. Various immunological indexes were determined.  Results  The number of antibody-producing cells and level of serum hemalysin in mice given Chongcaoduotai were increased, the function of nutrophil-phagocyte and phagocytosis of peritoneal phagocytes were enhanced. The delayed hypersensitivity in the mice was promoted and the activity of natural killer cells enhanced.  Conclusion  Chongcaoduotai is capable of enhancing the immune function of mice.
   
　　Key words：Chaongcaoduotai;  Immune function;  Mice

　　虫草多肽为蛹虫草经过酶解工艺直接制得的蛹虫草水解物，经浓缩，干燥而成。蛹虫草又名北冬虫夏草、北虫草，可寄生在鳞翅目、鞘翅目及双翅目等昆虫的蛹或幼虫体上。已有许多研究认为，蛹虫草的化学成份与冬虫夏草无根本性差异，具有与冬虫草类似的功能，可作为冬虫夏草的替代品［1，2］。本文以小鼠为观察对象，研究虫草多肽对免疫调节功能的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  虫草多肽由常州某保健药品有限公司提供，规格为0.5g/袋, 人体日推荐用量为8.33mg/kg BW。实验时取虫草多肽用蒸馏水分别配成2.08、4.17、8.33mg/mL浓度的溶液作为供试液；清洁级昆明种健康小白鼠由广西医科大学医学实验动物中心【批准号为：桂动许字(2000)第001号】提供。本中心实验动物房合格证号：桂医动字第23003号。动物房温度：22～25℃。相对湿度55%～70％。

　　1.2  方法  昆明种雄性小白鼠336只，体重为18～22g，供7项免疫试验用，每项试验4个组，每组12只。虫草多肽设41.7mg/kg、83.3mg/kg、166.6mg/kg·BW 3个剂量组，分别相当于人体推荐用量的5、10和20倍，按0.2ml/10g·BW的容量给予虫草多肽溶液，另设一个阴性对照组灌胃给予同体积的蒸馏水。每天1次，连续30d。末次灌胃1h后参照《保健食品检验与评价技术规范》［3］中的方法对小鼠进行免疫功能的测定。

　　1.2.1  脏器/体重比值测定  试验结束处死动物，取小鼠胸腺、脾脏，称量后计算脏器/体重比值。
   
　　脏器体重比值（%）=脏器重(g)/终体重(g)×100。

　　1.2.2  ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验（MTT法）  末次给样1h后处死动物、无菌取脾，制成脾细胞悬液(3×106个/ml)，按MTT法用754紫外可见光分光光度计在波长570nm处测定OD值。用加ConA孔的OD值减去不加ConA孔的OD值表示淋巴细胞的增殖能力。

　　1.2.3  二硝基氟苯诱导的小鼠迟发型变态反应（DTH）(耳肿胀法)  给样至25d将小鼠腹部皮肤脱毛后用二硝基氟苯（DNFB）溶液涂抹致敏，5d后将DNFB涂抹于小鼠右耳攻击，24h后处死小鼠，取8mm直径的耳片称重，左右耳重量之差表示DTH的程度。
   
　　肿胀度(mg)=右耳耳片重量(mg)－左耳耳片重量(mg)

　　1.2.4  抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法）  末次给样前5d给受试小鼠每只腹腔注射0.2ml 2%绵羊红细胞（SRBC）液进行免疫，5d后处死，无菌取脾制成脾细胞悬液，按Jerne改良玻片法进行抗体生成细胞测定，用空斑数/106脾细胞表示抗体生成细胞数。

　　1.2.5  血清溶血素的测定(凝集法)  末次给样前5d给受试小鼠每只腹腔注射0.2ml 2%绵羊红细胞（SRBC）液进行免疫，5d后从眼内眦取血分离血清用生理盐水倍比稀释，分别置于微量血凝板内，37℃孵育3h，观察血球凝集程度，利用血球凝集程度检测溶血素（SRBC抗体）水平。血球凝集程度分5级。
   
　　抗体积数=(S1+2S2+3S3…….nSn)
   
　　式中1、2、3……n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别。

　　1.2.6  小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验(半体内法)  末次给样后1h，给小鼠腹腔注射鸡红细胞悬液，注射后30min处死小鼠，腹腔注入2ml生理盐水，取腹腔洗液制片，放37℃培养箱内孵育30min，取出于生理盐水中漂洗后晾干，用1:1丙酮甲醛溶液固定，4%（v/v）Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水晾干。油镜下计数巨噬细胞，每张片计数100个，观察记录吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数，被吞噬的鸡红细胞数。
   
　　吞噬百分率(%)=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100
   
　　吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数

　　1.2.7  小鼠碳廓清试验  末次给样后1h经尾静脉给小鼠注射稀释的印度墨汁(用生理盐水稀释4倍)（10 mg/kg·BW），墨汁注入后立即计时，2min和10min分别从眼内眦取血20μl加到2ml 0.1%Na2CO3溶液中，用754紫外可见光分光光度计在600nm波长处测光密度值(OD)。处死小鼠，取肝脏和脾脏称重。按下式计算吞噬指数a。
   
　　a=K1/3×体重/(肝重＋脾重)
   
　　式中 K=(lgOD1－lgOD2)/(t2-t1) 

　　1.2.8  NK细胞活性测定(LDH测定法)  末次给样1h后处死动物、无菌取脾，制成脾细胞悬液(2×107个/ml)，取靶细胞(4×105个/ml)和效应细胞各100μl，加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40各100μl，上述各项各设3个平行孔，置5% CO2、37℃二氧化碳孵箱中培养4h。然后将96孔培养板以1 500转/min离心5min，每孔吸取上清100μl置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，反应8min，每孔加入1moL/L的HCL 30μl，在酶标仪490nm处测定OD值。按下式计算NK细胞活性。
   
　　NK细胞活性(%)=(反应孔OD－自然释放孔OD)/(最大释放孔OD－自然释放孔OD)×100%

　　1.3  数据统计  采用SPSS11.0软件，用方差分析进行统计学处理。

　　2  结果

　　2.1  虫草多肽对小鼠脏/体比值的影响  虫草多肽高、中、低剂量组的胸腺/体重及脾脏/体重比值分别为0.22±0.02，0.23±0.03，0.23±0.03和0.36±0.04，0.37±0.05，0.38±0.05，分别与阴性对照组0.23±0.03和0.38±0.04比较，差异均无显著意义(P>0.05)，提示虫草多肽对小鼠的免疫器官重量无明显影响。

　　2.2  虫草多肽对小鼠细胞免疫功能的影响  从表1可见，虫草多肽各剂量组的脾淋巴细胞转化OD差值均大于阴性对照组，但与阴性对照组比较差异均无显著性（P>0.05），表明虫草多肽对小鼠的脾淋巴细胞增值、转化无明显的促进作用。虫草多肽各剂量组小鼠的左右耳重量差值均大于阴性对照组，其中高、中剂量组与阴性对照组的差异具有显著性(P<0.01)，表明虫草多肽能提高DNFB诱导小鼠耳肿胀程度，具有促进迟发型变态反应的作用。

　　表1  虫草多肽对小鼠脾淋巴细胞转化及迟发型变态反应(DTH)的影响（略）

　　注：与阴性对照组比较, P<0.01。

　　2.3  虫草多肽对小鼠体液免疫功能的影响  从表2可见，虫草多肽各剂量组小鼠的抗体生成细胞数（空斑数）均高于阴性对照组，且高剂量组与阴性对照组的差异均有显著性（P<0.01），表明虫草多肽具有促进抗体生成细胞增值的作用。虫草多肽各剂量组小鼠的血清溶血素抗体积数均高于阴性对照组，高、中剂量组与阴性对照组的差异具有显著性（P<0.05），表明虫草多肽具有提高小鼠血清溶血素水平。

　　表2  虫草多肽对小鼠抗体生成细胞及血清溶血素的影响（略）
　　
　　注：与阴性对照组比较， P<0.05， P<0.01。

　　2.4  虫草多肽对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响  虫草多肽各剂量组小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率及吞噬指数均高于阴性对照组，吞噬鸡红细胞吞噬率(%)经数据转换后再进行统计分析，虫草多肽中剂量组的吞噬率和吞噬指数与阴性对照组的差异有显著性(P<0.05,P<0.01)，表明虫草多肽具有促进小鼠的巨噬细胞吞噬功能作用。虫草多肽各剂量组的碳廓清吞噬指数（a）与阴性对照组的差异均有显著性(P<0.05,P<0.01)，表明虫草多肽具有促进小鼠的单核-巨噬细胞碳廓清功能的作用。见表3。

　　表3  虫草多肽对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞及碳廓清的影响（略）

　　注：与阴性对照组比较, P<0.05, P<0.01。

　　2.5  虫草多肽对小鼠NK细胞活性的影响  虫草多肽各剂量组小鼠的NK细胞活性均显著高于阴性对照组，经数据转换后统计分析，虫草多肽高、中剂量组与阴性对照组的差异均有显著性（P<0.01），表明虫草多肽具有显著提高小鼠NK细胞活性的作用。见表4。

　　表4  虫草多肽对小鼠NK细胞活性的影响（略）

　　注：与阴性对照组比较, P<0.01。

　　3  讨论
   
　　药效学实验证实蛹虫草对实验动物的多项免疫指标均有明显增强作用，可促进淋巴细胞转化，提高肌体的细胞免疫功能；消除机体内超氧自由基；保护细胞膜稳定性及通透性；蛹虫草可明显提高NK细胞的活性，NK细胞是细胞免疫中的非特异性部份，可直接作为杀伤细胞发挥作用，是细胞免疫最重要组成之一,NK细胞具有良好的抗肿瘤作用［5～7］。研究提示，蛹虫草通过影响机体免疫系统的多个环节，增强机体的免疫功能。虫草多肽为蛹虫草经过酶解工艺直接制得的蛹虫草水解物，给予小鼠连续灌胃30d，能提高小鼠的抗体生成细胞数和血清溶血素水平，促进小鼠的单核－巨噬细胞碳廓清功能及腹腔巨噬细胞的吞噬能力。促进小鼠的迟发型变态反应，显著提高小鼠的NK细胞活性。由此可见，虫草多肽具有增强小鼠免疫力功能作用。

【参考文献】
  　　［1］ 贡成良，吴友良，朱军贞，等. 关于作为冬虫夏草代用品的家蚕蛹虫草研究［J］.药用植物研究, 1997, 6(1):46～53.

　　［2］ 彭国平，李红阳，袁永泰. 冬虫夏草与人工蛹虫草的成份比较［J］. 南京中医药大学学报, 1996,12 (5):26～27.

　　［3］ 中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范［S］.2003年版,22～34.

　　［4］ 崔新颖，崔新羽 ，张成义. 新型蚕蛹虫草对对小鼠免疫增强作用的实验研究［J］. 北华大学学报（自然科学版）, 2004,5(5):405～407.

　　［5］ 孙艳，官杰，王琪. 人工蛹虫草子实体对荷肝癌小鼠的抑制作用及提高NKJL-2活性的实验研究［J］. 中国药业，2002,11(7):39～40.

　　［6］ 贡成良，潘中华，郑小坚，等. 家蚕蛹虫草对小鼠免疫调节的影响［J］. 蚕业科学, 2004,30(4):386～389.

作者单位：广西壮族自治区疾病预防控制中心，广西 南宁 530021.