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【摘要】 目的 研究T辅助细胞不同功能亚群在慢性荨麻疹发病机制中的作用。 方法 采用Ficoil-hypaque密度梯度离心法，分离30例慢性荨麻疹患者外周血单一核细胞（PBMC），检测PBMC体外培养在植物血清素（PHA）诱导后Th1类细胞因子，γ干扰素（Interferon-gamma，IFN-γ）和Th2类细胞因子，白细胞介素4（Interleukin-4，IL-4）的变化，并设立20例正常对照。 结果 慢性荨麻疹患者组的PBMC在PHA诱导下产生IL-4水平明显高于正常对照组（P＜0.01)，而IFN-γ的诱导水平则低于正常对照组（P＜0.01)。 结论 慢性荨麻疹患者外周血存在着Th细胞亚群分化失衡，这可能为慢性荨麻疹发病的重要机制之一。
【关键词】 慢性荨麻疹 白细胞介素4 γ干扰素
Role of interleukin-4 and gamma-interferon in pathogenesis of chronic urticaria.
WU Dao-shen, WANG Tian-li, SHEN Ci-shi.
(Longgang District Chronic Disease Hospital of Shenzhen City, Shenzhen 518172, Guangdong, P. R. China)
Abstract：Objective To investigate the clinical significances of levels of interleukin-4(IL-4) and interferon-gamma(IFN-γ) in serum and peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) from patientts with chronic urtcaria. Methods The effects of IL-4 and IFN-γ in PBMCs and serum of patients with chronic urtcaria were determined by using Ficoil-hypaque density gradient centrifuge. Results The level of IL-4 produced by PBMC induced by PHA in the observation group was higher than that of the controls,showing significant difference （P＜0.05). The levels of IFN-γin serum in the observation group was lower than that of the control group, also showing a significant difference （P＜0.05). Conclusion The differentiation of Th cell subgroup in peripheral blood of patients with chronic urticaria is abnormal and this might be one of an important mechanism in the pathogenesis of chronic urticaria.
Key words：Chronic urtcaria; Interleukin-4; Gamma interferon
慢性荨麻疹常由多种因素引起，其发病机制可分为免疫性和非免疫性，与免疫反应相关的有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型变态反应，非免疫性是由组胺释放剂引起。近年来有学者提出T辅助细胞亚群功能失衡与过敏性皮肤病的发生相关，我们通过测定慢性荨麻疹患者外周血单一核细胞（PBMC）产生的白细胞介素4（IL-4）及γ干扰素（IFN-γ）水平，以探讨Th细胞亚群失衡在慢性荨麻疹发病机制中的作用。
1 对象和方法
1.1 研究对象 临床诊断符合慢性荨麻疹的患者30例，男性13例，女性17例，年龄 18～65岁，平均43.5岁，病程4个月～7.0年，平均20.5个月。入选和诊断标准：①皮肤突然出现大小不等、形状不一的风团，境界清楚；②皮疹此起彼伏，发无定处，剧烈瘙痒，消退后不留痕迹；③患者可有腹痛、腹泻、发热、关节痛等症状，严重可出现呼吸困难；④皮肤划痕试验阳性；⑤年龄大于或等于16岁，小于或等于65岁,性别不限；⑥病程大于或等于6周。对照组20例，其中男8例，女12例，年龄16～65岁，平均39.1岁。其本人及家属均无过敏史和免疫性疾病史。治疗组和对照组，在性别、年龄无统计学差异。所有患者及对照组均对本试验知情同意。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂 IL-4检测试剂盒（Diaclone Reserch，法国），rhIL-4（PeoroTech EC LTD，英国），淋巴细胞分离液（宝泰克，中国），IFN-γ检测试剂盒（晶美生物工程（北京）有限公司，中国），PHA（宝泰克，中国），RPMI-1640培养基（Sigma，美国）。
1.2.2 外周血PBMC培养上清的制备 无菌采集患者和对照组静脉血5ml，加到肝素抗凝管中（20u肝素），加等量含肝素的无血清RPMI-1640培养液悬浮细胞，将细胞悬液小心加在与血清等量的淋巴细胞分离液（Ficoll-Hypaque，d=1.077）上，室温水平离心1 000rpm 20min，分层。吸去最上层血浆，收集血浆液与淋巴细胞分离液交界的PBMC。用等量的含肝素的2%灭活小牛血清的RPMI-1640培养液离心洗涤3次，以去除残留的淋巴细胞分离液。用1%台酚蓝染色检测细胞活力并计数细胞，再用含10%小牛血清的RPMI-1640细胞培养液调细胞浓度至1×106/ml。分2组，一组只加入1%的植物血凝素（PHA）0.1ml，另一组除加入PHA外，再加入不同浓度的rhIL-4，置37℃ 5% CO2孵箱中培养48h，收集上清液置-20℃保存待测。
1.2.3 IL-4、IFN-γ的测定 无菌采集静脉血2ml，分离血清待检。采用双夹心ELISA方法。提前20min从冰箱里取出试剂盒，平衡至室温。将浓缩洗涤液用双蒸水稀释。用标准品/标本稀释液复溶冻干标准品，静置15min后混匀，然后进行倍比稀释。用生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体，当日配置，当日使用。用酶结合物稀释液稀释浓缩酶结合物，当日配置，当日使用。从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条，作好标记。加入标本和倍比稀释的不同浓度的标准品，空白孔和零孔加标本稀释液。用封板胶封住反应孔，室温孵育60～180min。甩掉孔内液体，每孔加350μl洗涤液，静止30s后甩尽液体，用厚迭纸吸干，洗4次。除零孔外，加入稀释好的酶结合工作液，每孔100μl，封住板孔，室温孵育30～60min，洗板4次。每孔加底物A、B各50μl，避光室温显色5～15min，并启动酶标仪。每孔加终止液50μl，在酶标仪内混匀后即刻在450nm处读数。绘制标准曲线，并计算标本浓度。
1.3 统计方法 全部资料应用SPSS12.0统计软件进行统计分析，计量资料采用两样本均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用配对t检验。
2 结果
2.1 慢性荨麻疹患者和对照组血清PBMC在PHA诱导产生IL-4 水平明显高于对照组（t=2.83，P＜0.05），而IFN-γ的诱导水平则低于对照组（t=3.01，P＜0.05），见表1。
表1 慢性荨麻疹患者和对照组血清PBMC产生IL-4 和IFN-γ的水平比较（略）
3 讨论
慢性荨麻疹俗称“风疹块”、“风团”，中医称为“瘾疹”，是一种常见的过敏性皮肤病。临床表现为皮肤和粘膜突然出现大小不等、形状不一的风团，境界清楚，皮疹此起彼伏，发无定处，剧烈瘙痒，消退后不留痕迹。有15%～25%的人一生至少发生过一次荨麻疹，发病率高，占过敏性疾病的80%以上，而慢性荨麻疹久治不愈，严重影响患者的工作和生活。慢性荨麻疹原因复杂，多数患者不能找到确切的病因，多数为I型变态反应，少数为II或III型变态反应［1］。
已有研究表明［2］，Th细胞按其分泌细胞因子不同而分为Th1和 Th2亚群，前者分泌IL-2、IFN-γ，后者分泌IL-5和IL-10等。体外试验表明IL-4能促进细胞合成IgE与IL-3协同刺激肥大细胞生长及组胺释放，在促发过敏反应形成中起主要作用［3］。IFN-γ主要作用于迟发型超敏反应和提高细胞毒反应，同时也可抑制IL-2细胞反应，降低人体内IgE应答［4］。本组研究发现慢性荨麻疹IL-4 水平明显高于对照组（t=2.83，P＜0.05)，而IFN-γ的诱导水平则低于对照组（t=3.01，P＜0.05)，提示慢性荨麻疹患者外周血存在着Th细胞亚群分化失衡，这可能为慢性荨麻疹发病的重要原因之一。分泌IL-4的Th2淋巴细胞亚群功能亢进，产生更多的IL-4，促进B淋巴细胞合成IgE，进一步促发过敏反应［5］。既然知道了Th1和 Th2细胞亚群失衡与慢性荨麻疹发病相关，那么通过调整Th1和Th2细胞亚群平衡，可以达到抑制免疫反应，控制慢性荨麻疹，为慢性荨麻疹的免疫治疗提供理论基础［6］。
【参考文献】
［1］ Moreira A, Rodrigues J, Delgado L, et al. Is Helicobacter pylori infection associated with chronic idiopathic urticaria［J］. Allergol Immunopathol (Madr), 2003, 31(4):209～214.
［2］ Martin K, Viera K, Petr C, et al. Simultaneous analysis of cytokines and co-stimulatory molecules concentrations by ELISA technique andof probabilities of measurable concentrations of interleukins IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, CXCL8 (IL-8), IL-10, IL-13 occurring in plasma of healthy blood donors［J］. Mediators Inflamm，2006，(5):65237.
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［4］ Feng H, Yamaki K, Takano H, et al.Suppression of Th1 and Th2 immune responses in mice by Sinomenine, an alkaloid extracted from the chinese medicinal plant Sinomenium acutum［J］. Planta Med, 2006,72(15):1383～1388.
［5］ Chaitidis P, O'Donnell V, Kuban RJ, et al. Gene expression alterations of human peripheral blood monocytes induced by medium-term treatment with the TH2-cytokines interleukin-4 and -13［J］. Cytokine, 2005 ,30(6):366～377.
［6］ Chtanova T, Tangye SG, Newton R, et al.T follicular helper cells express a distinctive transcriptional profile, reflecting their role as non-Th1/Th2 effector cells that provide help for B cells［J］. J Immunol, 2004,173(1):68～78.
作者单位：深圳市龙岗区慢性病防治院，广东 深圳 518172.