小鼠IL-5真核表达质粒的构建和体外表达

【摘要】  　　目的 构建小鼠白细胞介素-5（IL-5）基因真核表达质粒，了解该质粒在真核细胞COS细胞中有效表达情况。 方法 以含有小鼠IL-5基因的克隆质粒pORF9-mIL-5为模板，通过PCR 扩增小鼠IL-5全段基因，应用基因工程技术将扩增的基因片段插入pcDNA3.1（+） 真核表达质粒，构建重组真核表达质粒pcDNA-m IL-5，经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后，用脂质体转染技术转染COS细胞，用Western Blot 鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质。 结果 成功扩增了小鼠IL-5全长基因，酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-m IL-5，Western blot方法证实该质粒能在COS真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白。 结论 成功构建了小鼠IL-5基因的真核表达质粒载体，为进一步研究IL-5的新功能和免疫基因治疗奠定了基础。

【关键词】  白细胞介素-5 真核表达 质粒 基因工程

　　Construction and in vitro expression of an eukaryotic plasmid encoding murine IL-5.

　　TAN Guang-hong, WANG Cai-chun, HUANG Feng-ying,et al.

　　（Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Medicine, Hainan Medical College, Haikou 571101, Hainan, P.R. China）
　　Abstract：Objective  To construct a eukaryotic plasmid expressing murine interleukine-5 （IL-5） and test whether the plasmid can be expressed in the eukaryotic cell in vitro.  Methods  The full-length gene of murine IL-5 was amplified by PCR from the clonal plasmid pORF9-mIL-5. Then the murine IL-5 gene was inserted into the eukaryotic-expression plasmid pcDNA3.1（+）, the resultant recombinant plasmid was confirmed by restriction endonuclease and sequencing, then designated as pcDNA-mIL-5. The recombinant plasmid pcDNA-mIL-5 was transfected into eukaryotic cell COS by lipofectin. Western blot was used to certify whether the purpose protein was correctly expressed in COS cells.  Results  The 426 bp DNA sequence of murine IL-5 was correctly amplified. The recombinant pcDNA-mIL-5 was successfully constructed, and it could be correctly expressed in the COS cells.  Conclusion  This recombinant pcDNA-mIL-5 plasmid will provide a basis for immunogene therapy of allergic asthma.

　　Key words：Interleukin-5;  Eukaryotic expression; Plasmid; Gene engineering

　　支气管哮喘是一种慢性炎症性疾病，在支所管哮喘的慢性炎症形成过程中，嗜酸性粒细胞（EOS）起着十分关键的作用。研究表明，IL-5是ESO特异的趁化因子，可以激活ESO并诱导EOS向肺部浸润［1,2］。当前，已有多种临床前和临床试验证实，使用抗IL-5单克隆抗体治疗能够抑制EOS增生、抑制EOS趁化于肺部支气管粘膜、同时还能抑制EOS分泌各种活性的炎症介质，具有明显的治疗哮喘的作用［1,3,4］。但是，体外输注单克隆抗体是一种被动的过继免疫治疗，需要长期注射，成本比较昂贵，而且还可能引发十分危险的异常免疫反应，较难在临床中推广使用。因此，我们设想如果能通过主动免疫方法，诱导机体产生抗自身IL-5的抗体，就可能达到抗IL-5单克隆抗体一样的防治支气管哮喘的目的。为了能在小鼠哮喘模型中验证这一设想，我们首先blast比较分析了人和小鼠IL-5 二个分子的同源性，发现这二个分子在蛋白质水平的同源性达73%。因此认为重组人IL-5蛋白对小鼠来说是一种异种分子，如果将人IL-5重组蛋白作为疫苗免疫小鼠应该能够在小鼠体内诱导产生抗人IL-5的免疫反应。但是，由于人和小鼠IL-5还具有一定程度的同源相似性，人IL-5分子就可能含有小鼠IL-5产生相似或相同的抗原表位，有可能通过交叉反应诱导产生抗小鼠自身IL-5的抗体，从而达到主动免疫治疗的目的。为验证这一设想，我们在本研究中构建了小鼠IL-5的真核表达质粒，在体外转染COS细胞并进行表达鉴定，为以IL-5为靶标的支气管哮喘主动基因免疫治疗奠定基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  细胞株、质粒和宿主菌  COS细胞株、真核表达质粒pcDNA3.1（+） （Invitrogen） 和宿主埃希氏杆菌JM109为我院热带病重点实验室保存；含有小鼠IL-5全长基因的克隆质粒pORF9-mIL-5购自InvivoGen公司。

　　1.1.2  主要试剂  PCR 试剂盒、限制性内切酶、T4 噬菌体DNA连接酶和DNA marker 购自TaKaRa公司。纯化PCR产物试剂盒、质粒小抽试剂盒（Plasmid Mini Kit）为Qiagen公司产品。辣根过氧化物酶标记兔抗小鼠IgG、羊抗兔IgG、DAB显色试剂盒购自Vector lab公司，大鼠抗小鼠IL-5 抗体购自Santa Cruz公司，DMEM培养液、小牛血清和脂质体（lipofectamine）购自Gibco公司，其余试剂均为进口或国产分析纯。

　　1.1.3  主要仪器  梯度PCR仪（Biometra，Tgradient 96），凝胶成像系统（Tanon-4100），垂直电泳系统（Tanon，VE-180）。

　　1.2  方法

　　1.2.1  引物设计  根据克隆质粒pORF9-m IL-5的基因全序列设计扩增小鼠IL-5全段基因的引物，用引物设计软件Oligo6.0评价设计的引物符合要求，没有破坏IL-5基因的阅读框架。上游引物为5′-ATTGGTACCCTGAGATCACCGGTAGG AGGG-3′,下游引物为5′-CAAGATATCTCAGCCTTCCATTGCCC ACTC-3′，引物由宝生物技术有限公司合成。在上下游引物的5′ 端分别加入限制性核酸内切酶Kpn I和EcoR V的酶切位点，在酶切位点的5′ 端分别加入三个保护碱基。

　　1.2.2  PCR反应  以质粒pORF9-mIL-5为模板，用以上设计的引物，在梯度PCR 仪上进行扩增，获得小鼠IL-5胞外段全段基因（产物为426 bp）。PCR条件为：94℃ 30s，60℃ 1min，72℃ 1.5min，循环30次后72℃ 延伸10min。 4℃保存PCR产物, 取2～5μl 用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。

　　1.2.3  重组质粒的构建和鉴定  重组质粒的构建和鉴定     按文献方法［5］，将纯化的pcDNA3.1质粒和PCR 产物分别用Hind Ⅲ和XhoⅠ进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收并且纯化后，用T4 DNA 连接酶于16 ℃水浴中连接过夜。连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，于选择性LB 固体培养基（含100μg/ml 氨苄青霉素）上生长。第2d随机挑取单克隆菌落培养，取菌液0.5ml用等量双蒸水和酚氯仿粗提质粒，琼脂糖凝胶电泳进行初筛后挑选可能带有插入片段的重组质粒进行酶切鉴定。根据真核表达质粒pcDNA3.1（+）的序列设计两条引物，分别从插入片段的两端进行正向和反向序列测定。引物设计及测序交由大连宝生物技术有限公司完成。

　　1.2.4  重组质粒转染COS细胞 

　　参考文献   ［6］与Gibco BRL 公司提供的Lipofectamine脂质体转染操作手册进行真核表达质粒的体外表达。将COS细胞重悬于完全培养基中，在6 孔板中接种1.5×106孔。5%CO2、37℃培养箱中培养18～24h, 使细胞达到60%～80%的融合。用脂质体介导重组质粒转染，于无菌试管中准备A、B两种溶液。A液：将2μg DNA 溶于100μl无血清培养液；B液：将6μl lipofectamine脂质体溶于50μl 无血清培养液中。将A液与B液混合并混匀, 室温孵育30min，以形成DNA-脂质体复合体。弃细胞培养液, 用不含血清的培养液（DMEM） 洗涤细胞二次。0.8ml 无血清的DMEM培养液加入此复合体中, 混匀后小心滴加到COS细胞上。然后将COS细胞放入5%CO2、37℃培养箱中培养8～14h, 再向每孔中加入2ml 完全培养液，继续培养48h，收获细胞或上清液。

　　1.2.5  Western blot检测IL-5的表达  首先将转染细胞裂解液或培养上清用2×SDS混匀，100℃煮沸5min。接着用12%SDS 聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE） 电泳分离，将分离的蛋白质转移到PVDF 膜上, 用大鼠抗小鼠IL-5抗体作为一抗, 辣根过氧化物酶标记的小鼠抗大鼠IgG为二抗, 按文献方法［6］和相关说明书进行Western blot 分析。

　　2  结果

　　2.1  RT-PCR 扩增小鼠IL-5的分子量鉴定  本实验以质粒pORF9-m IL-5为模板，进行RT-PCR反应后，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，得到了一条大小约为426bp左右的单一条带，产物大小与预期一致，未见非特异性扩增的杂带及拖尾现象（图1 泳道1）。

　　2.2  重组真核表达质粒的构建和酶切鉴定  理论上，阳性重组质粒用Kpn Ⅰ和EcoR Ⅴ进行双酶结果应切出5.4kb的空pcDNA3.1（+）的线性片断和约426bp的插入基因片断的二条条带（图1 泳道3）。此外，经分析Nhe Ⅰ在空pcDNA3.1（+）质粒和插入的小鼠IL-5序列上均有一个酶切位点，故用Nhe I单酶切应将重组质粒切出约5.0kb和0.9kb的二个片段（图1 泳道4）。图1显示的酶切结果均与以上预计相符合。

　　图1  PCR扩增目的基因和重组质粒的酶切鉴定（略）

　　Figure 1  Amplification of the murine IL-5 gene and analysis of the recombinant plasmid

　　M：DNA分子量标准；2：PCR 产物；3：Kpn Ⅰ 和EcoR Ⅴ双酶切重组质粒pcDNA-mIL-5片段；4：Nhe Ⅰ单酶切重组质粒pcDNA-mIL-5片段；5：Kpn  Ⅰ单酶切空质粒pcDNA3.1片段。

　　2.3  重组真核表达质粒的测序鉴定  DNA 测序结果显示重组质粒pcDNA-mIL-5中插入基因长为426bp，与质粒pORF9-mIL-5和基因文库中报道的小鼠IL-5基因序列完全相同，插入方向正确，没有改变小鼠IL-5基因的阅读框架，保证了编码氨基酸序列的正确表达。

　　2.4  重组真核表达质粒真核表达鉴定  Western blot分析发现重组表达质粒转染的COS细胞出现了一条分子量约为15kD的新的条带（图2 泳道1），而转染pcDNA3.1（+）空质粒和没有转染重组表达质粒的COS细胞则没出现新的蛋白条带（图2 泳道2和3），说明重组表达质粒可以在真核细胞中有效表达。

　　图2  pcDNA-mIL-5转染COS细胞表达的Western blotting分析（略）

　　Figure 2  Expression identification of the recombinant plasmid using western blotting assay

　　1：转染pcDNA-mIL-5质粒的COS细胞裂解液；2：转染pcDNA3.1空质粒的COS细胞裂解液；3：未转染任何质粒的COS细胞裂解液。

　　3  讨论

　　不同的物种在进化中某些基因保持高度保守，即不同物种的相同组织类型或相同起源的组织细胞表达的某些分子在基因序列或/和蛋白质结构上呈现一定程度的相似性［7］，近来，已经有研究成果证实，利用异种细胞、DNA和蛋白质分子作为疫苗，都能够通过交叉反应诱导机体产生针对自身相应的同源分子的免疫反应，从细胞及分子水平证实了利用不同物种的同源基因或蛋白质分子来打破免疫系统对自身的正常分子免疫耐受这一理论的可行性［6,8,9］。IL-5是激活ESO并诱导EOS肺部浸润的主要细胞因子，其主要作用包括：1、作用于哮喘患者的造血系统，促使骨髓EOS成熟并释放于外周血中；2、促使EOS趋化聚集到哮喘病人气道粘膜中；3、使EOS活性明显增加，并呈剂量依赖性；4、使活化的EOS释放嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（ECP）增加；5、促进EOS产生过氧化物阴离子，还能增加过敏原和CA++诱导的EOS释放白三稀；6、增加EOS活化趋化因子mRAN的表达；7、抑制EOS的调亡，延长其存活时间，从而使EOS的数量增加［1,2］。可见，如能诱导产生抗自身IL-5的免疫反应，产生抗IL-5抗体，阻断IL-5的活性或功能，哮喘的气道炎症将极有可能得到良好的改善，是干预防治哮喘的理想靶点。本研究通过PCR克隆扩增了小鼠IL-5全长基因序列，并利用基因工程技术，将该基因序列插入真核表达质粒pcDNA3.1（+）多克隆位点Kpn I和EcoR V之间，获得了表达小鼠IL-5重组真核表达质粒pcDNA-mIL-5。在利用酶切和基因测序分析所构建的重组pcDNA-mIL-5质粒正确的基础上，应用细胞转染和Western blot技术在COS细胞中进一步证实本研究所构建的重组pcDNA-IL-5质粒可以有效表达目的基因小鼠IL-5产物。因此，pcDNA-mIL-5真核表达质粒的正确构建并且在COS细胞中有效表达目的蛋白，将为下一步提取活性的重组蛋白并应用于临床治疗提供了保障。此外，因为人和小鼠IL-5之间的同源相似性，将小鼠IL-5作为人IL-5的异种同源抗原分子，则有望在人体诱导产生抗人IL-5的免疫反应，为进一步探索异种IL-5作为疫苗是否具有防治哮喘的可能性奠定了基础。

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作者单位：海南医学院海南省热带病重点实验室，海南 海口 571101; 海南医学院附属医院呼吸内科,海南 海口 570102.