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【摘要】 目的 建立PCR优化条件和方法，探讨HBV C区基因在乙型肝炎PCR检测中的应用价值，为荧光定量PCR检测HBV摸索条件。 方法 将HBV基因组导入DH5α大肠杆菌，SDS碱裂解法小量提取大肠杆菌阳性构建质粒DNA，设计合适引物对HBV C区基因进行PCR扩增，对PCR条件中的退火温度、Mg2+浓度进行了优化，并比较三种不同Taq DNA聚合酶的灵敏度。 结果 转化的大肠杆菌质粒DNA最佳退火温度为58℃，最佳Mg2+浓度为1.5mM，同时确定天源公司的Biostar Taq DNA聚合酶灵敏度最高，扩增到10-6。 结论 确立了HBV C区PCR的优化条件，将为后期进行荧光定量PCR检测HBV感染奠定基础以及为探索更有效的检测方法提供实验依据。
【关键词】 乙型肝炎 HBV C区基因 克隆 PCR条件优化
Cloning of HBV Gene of C region and optimization of PCR conditions.
CHEN Si-li， YUAN Yuan.
（College of Life Science, South-Central Nationality University, Wuhan 430074， Hubei, P. R. China; College of Life Science, Central China Normal University, Wuhan 430079, Hubei, P. R.China）
Abstract：Objective To establish optimized conditions and methods of PCR and explore the applied value of dectection of HBV C-region gene for diagnosis of hepatitis B by PCR and offereing evidence in dectection of HBV by using fuorescent quatitative PCR. Methods Genome of HBV was transformed into Escherichia coli DH5αby utilizing CaCl2. SDS alkali cleavage method was used for extracting plasmid DNA in a small amount. HBV gene of C region was amplified by using self-designed primer. The anealing temperature and Mg2+ concentration were optimized. The sensitivities of three Taq DNA polymerases was compared. Results 58℃ was the best annealing temperature of the plasmid DNA of Escherichia coli, the best Mg2+ concentration was 1.5mmol/L, and the highest sensitivity of Taq DNA polymerase was as high as 10-6. Conclusion The optimized conditions has been established that has laid foundation for quatitiative detection of HBV by PCR and helpful for easrly clinical diagnosis of hepatitis B.
Key words：Hepatitis B; HBV gene of C region; Clonig; Optimization of PCR detecting conditions
HBV是一种逆转录病毒,其逆转录过程为利用病毒本身DNA聚合酶进行，缺乏校对酶活性,具有高度的变异性。病毒基因一个或多个核苷酸的变异均可导致HBV编码的蛋白质发生变化,引起病毒变异。目前认为,HBV 的前C 区变异可导致乙型肝炎病人病情活动和慢性化,并与重型肝炎的发生有一定关系。因此,HBV 前C 区变异成为目前研究的热点。目前乙型肝炎病毒的病毒学诊断，主要依靠血清学方法检测HbsAg，HbeAg及抗-HBs，抗-HBc，抗-Hbe，统称二对半抗原抗体系统，临床上作为乙型肝炎病毒的特异性诊断指标，筛选献血员，人群乙型肝炎病毒的流行病学调查，检测乙型肝炎疫苗接种效果［1～3］。但这些方法灵敏度低, PCR灵敏度高,但容易污染,如果引物设计不当,有假阳性或假阴性结果。我们研究HBV C 区基因PCR检测乙型肝炎的应用价值，并对其实验条件进行了探索。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 试剂 pGEM-T载体（带有HBV C区基因,由中南民族大学生命科学学院提供），胰蛋白胨,酵母提取物（均为Oxoidford公司），引物（Invitrogen 公司），dNTP（上海申能博彩公司），iTaq酶（Bio-Rad公司），Taq DNA酶（天为时代公司），Biostar酶（天源公司），琼脂糖，Marker Ⅵ、50 bp Marker（天为时代公司），Lambda DNA/Hind Ⅲ Marker（天源公司），EcoRⅠ限制性内切酶（Takara 公司）。
1.2 感受态细胞的制备与转化［1］ 将HBV基因组导入DH5α大肠杆菌受体细胞。用CaCl2诱导受体细胞使其成为“感受态”；涂布平板筛选转化重组子（挑取白斑于液体LB培养基中振荡培养过夜）。
1.3 SDS 碱裂解法小量提取质粒 收集转化的大肠杆菌细胞、碱裂解细胞，回收和纯化质粒DNA。
1.4 引物设计 设计合适引物对HBV C区基因PCR扩增，本实验所用的引物由Iinvitrogen 公司合成。HBV C区基因引物序列：正向引物:5'-GTTTATGTGTAATAGTCGAA-3'反向引物:5'-GCGCTCGAGTTCCTATACTA-3'
1.5 PCR 反应体系 10×PCR 缓冲液5μl；50mmol/L MgCl2 1.5ml；10mmol/L dNTP 1μl；20μM引物1与引物2均为1μl；Taq DNA 聚合酶0.5μl；质粒DNA 2μl；ddH2O补至50μl。
1.6 PCR退火温度的优化 在PTC-200 PCR 仪上设定56℃～60℃温度梯度, 进行HBV C区基因扩增。PCR热反应循环程序为：94℃预变性10min，94℃变性30s，56℃～60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环，72℃延伸10min。反应结束后，从设定的程序中记录每个PCR管的温度，取PCR产物，琼脂糖凝胶电泳鉴定，确定最佳退火温度。
1.7 Mg2+浓度的优化 PCR反应体系中分别加入50mmol/L MgCl2 1.5μl，1.75μl，2.0μl，2.25μl，2.5μl，2.75μl，3.0μl，3.25μl，使反应体系中Mg2+终浓度分别1.5mmol/L，1.75mmol/L，2.0mmol/L，2.25mmol/L，2.5mmol/L，2.75mmol/L，3.0mmol/L，3.25mmol/L, 进行HBV C区基因扩增，取PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定，确定最佳Mg2+浓度。
1.8 三个不同来源（即Bio-Rad公司、天为时代公司和 Biostar天源公司），Taq DNA 聚合酶灵敏度的比较 将提取质粒进行10倍梯度稀释成10-1～10-9九种浓度，分别做模板进行HBV C区基因扩增，取PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定，确定最佳灵敏度的Taq DNA 聚合酶。
2 结果
2.1 质粒电泳和酶切电泳图
2.1.1 质粒电泳 挑选阳性质粒与Marker Ⅵ在0.7%琼脂糖凝胶中电泳,初步判定重组质粒大小正确。见图1。
图1 HBV C区基因的质粒电泳图（略）
M:DNA标记Marker Ⅵ; 1,2:质粒DNA,片段长度为10000bP
2.1.2 酶切电泳 为进一步确定重组质粒的正确性，EcoRⅠ 酶切重组质粒，产物用0.7%琼脂糖凝胶电泳检测。见图2。
图2 HBV C区基因的质粒酶切电泳图（略）
M: Lambda DNA/Hind Ⅲ Marker; 1-10:EcoR I 酶切质粒DNA,片段长度为6000bp和4000bp
2.1.3 PCR最佳退火温度 56℃～60℃的12个温度为56℃、56.1℃、56.4℃、56.7℃、57.2℃、57.8℃、58.4℃、59.0℃、59.4℃、59.7℃、59.9℃和60℃。见图3。
图3 HBV C区基因PCR 扩增退火温度电泳图（略）
M:50bpMarker; C:对照; 1-12:质粒DNA PCR退火温度依次递增,片段长度为100bp
2.1.4 PCR最佳Mg2+浓度 50bp Marker第1泳道为阴性对照,第2到10 的Mg2+终浓度分别1.5mM、1.75mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM和3.25mM。见图4。
图4 HBV C区基因PCR 扩增Mg2+浓度梯度电泳图（略）
M: 50bpMarker; 1:阴性对照; 2-10:质粒DNA PCR扩增Mg2+浓度依次递增,片段长度为100bp。
2.1.5 Taq DNA聚合酶的最佳灵敏度 以天源公司的Biostar Taq DNA聚合酶扩增到10-6，天为时代公司的Taq DNA聚合酶扩增到10-4，而Bio-Rad公司的iTaq扩增到10-3。
3 讨论
3.1 本研究对HBV C区基因进行了克隆，从图1结果可见，产物清晰，只有一条带，证明对HBV C区基因的克隆是成功的，不需对产物做凝胶纯化。图2结果也得到证明。
3.2 为了扩大PCR在HBV检测中的应用，我们对实验PCR条件作了优化研究，主要的优化变量包括退火温度、Mg2+浓度﹑和Taq DNA 聚合酶灵敏度［4,5］。
3.2.1 退火温度通过作梯度PCR获得。首先用公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估算Tm值，由于碱基错配﹑缓冲液中各成分甚至反应物和模板浓度的不同都会影响Tm值。进行PCR退火温度一般间隔2～5度，本实验将温度设定在56-60度之间。梯度PCR之后做电泳检测得第七和第八条带最亮（图3），从而得出最佳退火温度为58℃。
3.2.2 镁离子浓度是一个容易控制的参数，所有浓度的变化都可在不同的反应管中同时进行。dNTP是PCR反应中磷酸基团的主要来源，而且其浓度的任何改变都会影响有效Mg2+浓度。首先对反应体系进行了优化，再进行Mg2+浓度的探索。本实验Mg2+浓度增幅为0.25mmol/L, 即从1.5mmol/L到3.25mmol/L的一系列反应，由图4结果确定最佳Mg2+浓度是1.5mmol/L。
3.2.3 确定最佳Mg2+浓度为1.5mmol/L之后，对三种不同来源的Taq DNA 聚合酶作了灵敏度比较研究。天源公司Biostar Taq DNA 聚合酶灵敏度为10-6，灵敏度最高。天为时代公司的灵敏度为10-4， Bio Rad公司的灵敏度为10-3。
3.3 从本研究结果可知，HBV C区基因PCR检测技术应用于预防医学、妇幼保健、口腔医学和临床医学领域有着广阔的前景。
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作者单位：中南民族大学生命科学学院，湖北 武汉 430074； 华中师范大学生命科学学院, 湖北 武汉 430079.