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【关键词】 卵巢癌 铂类药物 化疗 耐药性
化学药物治疗是治疗妇科恶性肿瘤特别是卵巢癌的重要手段之一。自上世纪80年代初铂类抗癌药问世以来,卵巢癌的疗效,尤其是近期效果,有较明显的改观。上皮性III期卵巢癌,手术+铂类药物化疗,中位生存期从12～18个月提高到24个月［1］。目前,常采用的化疗方案有CAP、CBP、TP、TTP及VBP等,均包含铂类药。但这些方案治疗后达临床缓解者,复发率仍高达50%以上。
在卵巢癌的化疗中铂类化合物(如顺铂及卡铂)是诸多药物中最有效的,近来的研究表明铂类药物的细胞毒作用是通过形成了铂-DNA络合物,导致DNA致命的损伤,诱导细胞凋亡(apoptosis)而发挥作用。但是肿瘤的耐药性又始终是影响化疗效果的最大障碍,且对于耐药问题的研究目前多局限于对卵巢癌细胞系方面,而在临床方面的研究却并不多见,综合各家观点,卵巢癌对铂类药物耐药性产生的机制可能和以下因素有关。
１ 相关染色体变化
Takano等［2］用比较基因组杂交技术筛选顺铂耐药细胞系中异常染色体区,发现染色体6q21～25 区复制水平升高,而7q21～36 区和10q12～15 区复制水平降低。同时研究28 例原发性上皮性卵巢癌患者,发现在耐药组患者中广泛存在1q21～22 、13q12～14 区功能增强。故认为这些区域的基因变化可能是潜在耐药性标志。
２ 相关基因变化
Sakamoto等［3］应用cDNA微阵列对卵巢癌顺铂敏感株KF和耐药株KFr、KFrP200进行研究,发现谷氨酰转肽酶π的mRNA表达随顺铂耐药性的升高而升高。在对顺铂3倍耐药的KFr中与DNA修复有关的基因XRCC5、XRCC6、ERCC5、hMLH1等过表达,在对顺铂30倍耐药的KFrP200中凋亡抑制基因胰岛素样受体Ⅰ(IGFRⅠ)、IGFRⅡ均过表达,而凋亡诱导因子caspase3、Bak表达受抑制。
酵母菌中含有一种富含丝氨酸精氨酸蛋白特异性激酶1(Serine/arginine 2 rich protein 2 specific kinasefrom budding yeast,SKY1),Schenk等［4］发现该激酶的功能受到破坏后可导致细胞对顺铂耐药。而将SKY1的同系物人富含丝氨酸精氨酸蛋白特异性激酶(Serine/arginine 2 rich protein 2 specific kinase,SRPK1)表达于SKY1缺失突变的酵母菌中其仍具有对顺铂的敏感性,因此提示SRPK1是一种顺铂敏感性基因。而在人卵巢癌A2780细胞中应用SRPK1的反义脱氧寡核苷酸链阻止SRPK1翻译起始区,可导致SRPK1表达下调,并使其对顺铂的耐药性提高4。这表明SRPK1基因与顺铂诱导的细胞死亡有关,可作为研究临床耐药的重要方面。Pan等［5］在顺铂敏感株A2780和耐药株C30中分别应用ISIS、10582(一种c2jun反义脱氧寡核苷酸),在C30中观察到c2jun mRNA的表达水平下降,且γ2谷氨酰半胱氨酸合成酶mRNA的表达也下调,细胞内谷胱甘肽水平下降,但在A2780 中未见到γ2谷氨酰半胱氨酸合成酶mRNA下降。用四氮唑蓝比色法显示C30中的顺铂50%抑制浓度(IC50)在应用c2jun反义链后由18.2mmol/L降至3.7mmol/L。而A2780暂时转染c2jun表达载体后c2jun的蛋白含量升高9.2倍,谷胱甘肽浓度升高10.7倍,顺铂的IC50升高2倍。故由此推论转录因子c2jun表达的调节对耐药起作用。Sellar等［6］发现同源框基因BARX2在顺铂敏感株中的表达高于耐药株,在顺铂治疗后又复发的患者中该基因表达下调。而转染BARX2基因可使顺铂耐药株对顺铂敏感性明显增加。由此可见,该基因在决定细胞对顺铂毒性的敏感性方面有一定作用。
３ 凋亡相关因子
IAP家族是新发现的一组凋亡蛋白抑制因子,通过抑制caspase发挥蛋白水解酶作用而阻止细胞凋亡,家族成员主要包括:NIAP、XIAP、HIAP21、HIAP22 和survivin。Li等［7］应用顺铂敏感株OV2008、A2780S 和耐药株C13、A2780CP 研究发现,XIAP 和HIAP22在卵巢癌增生细胞中呈高表达,但在凋亡细胞中无表达。
顺铂可持续降低敏感株内XIAP蛋白表达且诱导凋亡,但在耐药株中顺铂不能改变XIAP和HIAP22的量,也不能诱导凋亡。用腺病毒转染而致的XIAP过表达在敏感株中可以减少顺铂诱导的细胞凋亡。XIAP反义链表达可诱导耐药株和敏感株细胞凋亡,但在后者作用要强。这表明在卵巢癌中XIAP是肿瘤生长控制的重要因素,并且可能是顺铂诱导凋亡的一个调节点。而顺铂下调XIAP的作用可能是化疗敏感性的重要方面。Mansouri等［8］用顺铂敏感细胞株2008和其耐药亚克隆2008C13进行研究,发现顺铂耐药性与XIAP基因表达增强有关。而在2008C13中应用顺铂后Fas2L的作用消失。在顺铂敏感株中,XIAP不能激活,但凋亡诱导剂Fas2L表达却升高。表明XIAP表达和Fas2L下调参与了卵巢癌中顺铂耐药,且在其中可能代表一种新的抗凋亡机制。
4 顺铂细胞内蓄积影响因素
通过对卵巢癌细胞系的研究,发现卵巢癌细胞的耐药表型可能和细胞内铂类化合物的蓄积减少有关。
xc2运输系统是一种异二聚体氨基酸运输载体,由xCT和4F2hc两种蛋白组成,在介导胱氨酸摄入同时伴随着细胞内谷氨酸排出,并可调节谷胱甘肽水平。Okuno等［9］应用顺铂敏感株A2780和耐药株A2780/DDP研究发现,在A2780/DDP细胞内谷胱甘肽水平明显升高,而且胱氨酸的摄取速度是A2780的4.5倍。A2780/DDP中胱氨酸摄取速度是由xc系统来介导的,但在细胞有过量谷氨酸时,谷胱甘肽水平明显下降,从而抑制胱氨酸摄取。在A2780/DDP中,xCT和4F2hc的mRNA有明显表达,但在A2780细胞中表达明显减少。而A2780细胞转染xCT和4F2hc后对顺铂的耐受性升高。由此推论xc系统通过保持细胞内高水平谷胱甘肽来介导顺铂耐药。Komuro等［10］研究了3种卵巢癌细胞系即KF(顺铂敏感)、RTSG(内在耐药)、KFra (获得性顺铂耐药),并分别对其应用顺铂加紫杉醇和顺铂加SN238(伊立替康的一种活性代谢产物)的联合化疗,发现联合用药时药物的抗癌性有协同作用。在KF中观察到时间依赖性的顺铂蓄积而在KFra中顺铂的量却下降,RTSG中则几乎见不到顺铂的蓄积,提示耐药性与顺铂的蓄积有关。在应用紫杉醇和SN238后3种细胞中均见到顺铂蓄积。在KF、KFra 两种细胞株中,应用钠钾ATP酶阻滞剂毒毛花甙G可以减少顺铂的蓄积,同时可抑制紫杉醇SN238增加顺铂蓄积的作用。研究还显示顺铂联用紫杉醇和SN238可下调多药耐药蛋白mRNA表达,而顺铂单用可以上调其表达,结果提示紫杉醇和SN238可通过改变顺铂细胞内蓄积(包括药物摄入和外流)以及对多药耐药蛋白表达的影响来克服耐药性。Katano等［11］的研究应用3对人卵巢癌细胞系(A2780、2008、IGROV21 和相应耐药株A2780/ CP、2008/ C13*5. 25 IGROV21/CP)发现顺铂耐药与铜有交叉耐受。应用顺铂1h后耐药株的顺铂蓄积量仅为敏感株的38%～67%,DNA复合物形成量为敏感株的10%～38%。顺铂耐药株的细胞内基础铜水平较敏感株低22%～56% ,在暴露于含铜介质24h后耐药株细胞内的铜水平仅为敏感株的27%～46%。耐药株中顺铂的摄入速度是敏感株的23%～55% ,而铜的摄入速度耐药株是敏感株的56%～75%。进一步分析显示每种耐药株中均有铜输出泵表达升高。故认为卵巢癌中顺铂耐药性与顺铂在细胞内的药理学有关,而顺铂与铜的摄取和外流的变化平行。这与顺铂通过介导铜稳态运输介质来进出细胞的概念一致。
５ 谷胱甘肽S转移酶（GSTs）酶性解毒作用增加
谷胱甘肽S转移酶是一组具有多种生理功能的蛋白质。GSTs亚基类型多种多样，结构也很复杂，其基本的主要生理功能是参与机体解毒。研究表明：与肿瘤细胞多药耐药密切相关的GSTs亚型主要是GST-α、GST-μ和GST-π，同时不同类型的GSTs对不同的抗癌药有一定特异作用。
GSTs表达导致肿瘤耐药的可能机理为：①它可催化谷胱甘肽与各种亲电子分子和疏水性分子结合，使其更有极性而加强外排。而在常用化疗药中铂类药物都具有亲电子性的特点，因此不可避免地成为GSTs的底物，而导致肿瘤细胞内药物外排增加，对肿瘤细胞毒性下降，而出现耐药。Goto等［12］的研究发现，通过导入外源性GST-π基因入顺铂敏感的细胞系后，该细胞的GST-π mRNA表达与对顺铂耐药程度以及细胞内谷胱甘肽—顺铂加成物浓度呈正比。这为上述理论提供了实验依据。②它可通过非酶结合的方式将细胞内的毒性化学药物排除，从而达到解毒的目的。Arnstrong等［13］研究发现，当导入外源性GST-π基因或在诱导癌细胞耐药过程中细胞表达GST-π时，其细胞内的化疗药物特别是铂类药物的贮留量明显减少并出现MDR表型包括对铂类药物耐药。
６ 与谷甘肽（GSH）结合增加
谷胱甘肽是机体内的一种非特异性解毒物质。对肿瘤细胞免受脂质过氧化酶的破坏起保护作用。谷光甘肽的合成依赖于其前身如谷氨酸(Glutamate)的产生,此过程是通过γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,GGT)来完成的。谷光甘肽是在γ-谷氨酰半光氨酸合成酶(γ-glutamyl-cysteine synthetase,GCS)和谷光甘肽合成酶(glutathione synthetase)的催化下而产生的,谷光甘肽合成的第一步是由GCS催化的限速反应,此反应可被buthionine sulfoximine抑制。
在耐药状态下，肿瘤细胞内的化疗药物与GSH结合增加并使其对化疗药物的解毒作用增加或肿瘤细胞内药物外排出增加，对肿瘤细胞的毒性下降。主要依据有：①顺铂耐药的卵巢癌细胞中GSH的浓度明显高于非耐药者。Godwin等［14］采用顺铂诱导卵巢癌细胞系耐药，发现随着卵巢细胞对顺铂耐药程度的增加，细胞内GSH水平也随之增加，顺铂重度耐药的细胞，其GSH水平较正常细胞增加近50倍，顺铂耐药和胞浆内GSH水平的相关系数高达0.96。Abe等［15］的研究也得到类似结果。el-akawi等［16］在采用顺铂诱导A2780耐药后，γ-GTmRNA表达（2.5～8倍）以及酶活性（2.7～2.8倍）增高，而这种表达增高与顺铂的诱导浓度和耐药细胞内GSH浓度增高呈正比。因此，认为治疗浓度的铂类制剂诱导A2780细胞表达，翻译γ-GT引起GSH增高而产生耐药。其三，Goto等［17］的体外实验中GST-π mRNA表达、GSH和GSH-顺铂加成物增加，细胞内的顺铂浓度下降。但GSH激活的Mg++-ATP酶活性无改变。因此，认为 顺铂诱导γ-GCS的转录、翻译，进而引起GSH水平增高。
７ 细胞外基质
Sherman Baust等［18］发现在顺铂耐药的卵巢癌细胞中多种细胞外基质的基因功能上调,其中COL6A3上调最明显。顺铂敏感细胞在有胶原Ⅵ存在情况下培养可增加细胞对顺铂的耐药性。随后证实卵巢肿瘤中的确存在胶原Ⅵ,而且胶原Ⅵ与肿瘤分级有关,表明肿瘤附近的细胞外基质进行了重新组织。结果提示卵巢癌细胞可通过改变微环境来提高顺铂耐药性。
８ DNA损伤修复相关因素
经过研究发现由于铂引起的DNA损伤的修复开始于核苷酸切补修复旁路(Nucleotide excision repair pathway),据估计有相当数量的酶可能参加此过程。在对于铂类药物耐药卵巢癌细胞系的研究过程中发现铂络合物丢失的加速及DNA合成酶的合成的增加,从而反应了DNA修复的加速。核酸切除修复通路参与了与顺铂结合的DNA修复过程。核酸切除修复交叉互补基因(ERCC1)是该通路的基本基因之一,其表达升高与顺铂耐药有关。Selvakumaran等［19］对顺铂敏感细胞株A2780和高度耐药的OVCAR10分别表达反义的ERCC1RNA,可以使细胞对顺铂的敏感性明显增加。A2780细胞在表达后对药物敏感性增加了1.9～8.1 倍,而OVCAR10表达后顺铂IC50从原来9.52mmol/L降低至2.28～2.7mmol/L,同时观察到DNA损伤修复能力也下降。研究结果提示可通过破坏核酸切除修复通路方式获得对顺铂的敏感性。
综上所述,卵巢癌对铂类药物的耐药机制十分复杂,而且许多方面还不甚清楚,如前所述许多已知和未知的因素参与癌细胞产生耐药性的过程,了解肿瘤细胞产生耐药性的机制以及各种细胞生物学指标在耐药性产生过程中所起的作用是十分重要的,它可以指导我们根据患者的具体情况合理地选择相应的化疗方案,合理地选择相对应的、特异的耐药修饰剂,也许会不同程度地改善卵巢癌的预后。
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作者单位：海口市人民医院妇产科，海南 海口 570208； 深圳市南山区妇幼保健院，广东 深圳 518052； 白求恩医科大学第二临床学院，吉林 长春 130021.