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【摘要】 目的 研制PLGA为载体的一针剂免疫乙肝疫苗,观察该疫苗的注射部位炎症及分析使用者的依从性。 方法 采用复乳溶剂法制备乙型肝炎疫苗微球,单剂注射到实验兔后腿肌肉内观察病理学反应,并随机调查100人对一针免疫乙肝疫苗的使用看法。 结果 HBsAg-PLGA微球包裹率达55%以上且制备工艺稳定,剂型生物兼容性及注射人群依从性表现良好。 结论 HBsAg-PLGA缓释疫苗具有一定的研究开发价值。
【关键词】 乙肝病毒表面抗原 乳酸/乙醇酸共聚物 微球 乙肝疫苗 一针免疫 依从性
Preparation and investigation of HBsAg loaded poly (lactic-co-glycolic acid) microspheres.
YIN Wen-guo, XU Wan-guo，LI Yu-hui,et al.
(Jilin Pharmaceutical Design Institute Co. Ltd,Changchun 130021, Jilin, P. R. China; Pharceutical College of Jilin University, Changchun 130021, Jilin, P. R. China)
Abstract：Objective To prepare a PLGA microspheres containing HBsAg and evaluate their characteristics and injection compliance. Methods Hepatitis B surface antigen was encapsulated in poly lactide-co-glicolide acid (75/25) microspheres using double emulsion solvent evaporation method. The injection compliance and biocompatibility of the microspheres was also observed. Results The encapsulation of microspheres was higher than 55 %,27% of the surveyed believe that they will use this HBsAg-PLGA single dose vaccine and there were few inflammatory responses at the injection site. Conclusion The HBsAg-PLGA vaccine has a certain value of the research and development.
Key words：Hepatitis B surface antigen；Poly–Lactide-co-glicolide acid； Microspheres；Single dose vaccine；Compliance
中国是乙型肝炎病毒的高流行区,乙型肝炎病毒感染可导致慢性肝炎、肝硬化以及原发性肝癌。目前尚无特效药物治疗, 而乙肝疫苗的广泛应用可对乙肝病毒的流行起到非常重要的遏制作用，是我国最为重要的预防性药物［1］。现有疫苗中，乙肝疫苗是接种针次较多常造成患者不能完成全程接种免疫失败。因此，新佐剂的开发也必须在提高疫苗效果的前提下最大限度地减少注射针次。聚乳酸－乙醇酸［Poly（lactic-co-glycolic acid）, PLGA］微球技术包裹病毒抗原形成缓释颗粒是有效的措施之一。聚乳酸－乙醇酸有良好的生物相容性和生物降解性能且降解速度可控，在生物医学工程领域有广泛的用途。目前已被制作为各种组织工程支架材料及药物缓释载体。各种PLGA 药物微球在国外也已上市多种，本研究以PLGA作为载体微球作为疫苗的载体，制备新型的乙肝（缓释）疫苗，以达到提高乙肝疫苗体液与细胞免疫，减少注射针次的目的。
1 材料与方法
1.1 材料 PLGA75 /25 (乳酸/乙醇酸比率即L /G比为75 /25)（美国伯明翰公司）；重组乙肝病毒表面抗原(HBsAg)原液及乙肝疫苗(长春生物制品研究所)；实验兔（长春生物制品研究所动物实验中心）。
1.2 方法
1.2.1 制备方法 采用乳化溶剂挥发法制备微球，将HBsAg原液加至溶有PLGA 的二氯甲烷溶液中，以6500rpm的搅拌速度制成w/o 初乳，再将此初乳缓缓注入装有1%浓度PVA的冰水浴保持0℃的5L水溶液，在自制的复乳搅拌反应器复乳搅拌形成w/o/w 复乳。然后以低速搅拌，其间用真空泵向反应器中进气，并伴用抽风机从反应器内向外排气，3h后即得固化的微球。所得微球用0. 45μm 微孔滤膜抽滤收集，在抽滤器上用蒸馏水反复冲洗。微球再经冷冻干燥得到微球粉末。取30mg通过Beckman Coulter LS 13320进行粒径检测并通过扫描电镜进行形态学观察。用萃取法得到HBsAg原液溶液后经BCA法测定包裹率［2］。进行体内注射研究的微球依次用蒸馏水和15％的甘露醇冲洗。收集微球后加入羧甲基纤维素钠和甘露醇等辅料后，混匀再经冷冻干燥得到可注射的微球粉末。
1.2.2 注射部位炎症检测 选实验兔6只,放置规定架上,静置1h后,对每只兔子体温测量两次并记录。称取300mg乙肝疫苗微球溶于3ml含15%甘露醇的水溶液后，以臀部肌肉深部注射方式注射到实验兔体内。并取30mg乙肝疫苗微球随机注射进3只实验兔的耳静脉中并分组计号。以后每隔30min用带有探头的微机热源测温仪测试体温1次,共测量6次。1周后随机处死3只实验兔，并取实验兔后腿肌肉作病理学分析，6月后处死另3只实验兔，取实验兔后腿肌肉作病理学分析。
1.2.3 注射人群依从性分析 以问卷调查及询问方式在吉林大学新民校区及长春生物制品研究所家属区随机调查共100人，统计对一针免疫乙型肝炎疫苗的看法。
2 结果
2.1 型态学结果 依复乳溶剂挥发法制得的微球外表光滑，批次重复性好并且大小适中（见图1～2）。制备过程测得包裹率为55%～60%，其中每批次微球的包裹率测量误差小于2%。平均粒径27.66μm，均一性好。
图1 40倍显微镜下微球图片（略）
图2 粒径检测仪检测图谱（略）
2.2 注射部位炎症检测结果 6只实验兔的体温均保持在37.8～39.3度。1周后对处死的实验兔的后腿臀部肌肉解剖后可见被部分白色囊膜状物质包裹的微球，两只实验兔臀部肌肉有炎症。6月后处死的实验兔的后腿臀部肌肉解剖后，只有1只实验兔臀部肌肉中发现絮状白色物，3只实验兔臀部肌肉病理切片上看似有肉芽肿状物。
2.3 注射人群依从性分析 在被调查的100人中，有男性53人，女性47人，年龄最大71岁，最小15岁。有41%的人接受注射过乙型肝炎疫苗，其中检查出产生抗体的占22%。调查中承认患有乙型肝炎的有3人，承认被乙型肝炎病毒感染的有7人。对于一针免疫的乙型肝炎疫苗，56%的人最关心新剂型的免疫效果，32%的人最关心新剂型的价格，8%的人最关心新剂型的副作用。所有人都假设自己未注射过乙肝疫苗时：对于一针免疫的乙型肝炎疫苗使用的看法上，其中41%的人认为自己会使用，53%的人认为会优先考虑。当得知一针免疫的乙型肝炎疫苗的针头较粗，可能有注射疼痛感后，27%的人认为自己会使用，43%的人认为会优先考虑。
3 讨论
3.1 按“微囊、微球与脂质体制剂指导原则［3］”微球包裹率未达到80 % ,笔者认为此项规定并不符合实际。经过均匀设计筛选方案数十次，包裹率最多可达65%，始终未能达到80%以上的包裹率。由于PLGA可完全降解，似乎包裹率只与生产厂家的投药量和原药成本有关系。
3.2 两组实验兔体温未有差异，既符合热源检验要求。证明此批次微球无热源。病理学检验显示乙肝疫苗微球可使注射部位产生炎症，但经过半年后，可逐步减轻。肉芽肿状物疑为PLGA产生，但因为PLGA可完全降解且不损害肌肉组织，笔者认为随着时间推移，炎症亦可消除，恢复正常。
3.3 调查显示，大部分人均接受注射过乙型肝炎疫苗，但一些人并不知道自己是否有抗体，80%的人并没有定期身体检查的计划。其次,乙肝疫苗接种后进行加强免疫的仅占不到十分之一，乙肝疫苗接种3～5 年后,机体内的保护性抗体效价降低,不足以抵抗再次感染,所以很容易重新感染上乙型肝炎［3］。一针免疫乙肝疫苗的开发可保持疫苗接种的全程性，是非常科学有效的预防接种方法，易于推广施行。因此一针免疫乙肝疫苗将大大普及人群中乙肝疫苗的接种, 使疫苗的接种达到应有的免疫效果，减少乙肝病毒的传播。
【参考文献】
［1］ 童利学，童璐莎. 乙肝疫苗的研究进展及展望［J］. 现代实用医学, 2007,19(1):81～84.
［2］ Li Feng, Xian Rong Qi, Xing Jun Zhou,et al. Pharmaceutical and immunological evaluation of a single-dose hepatitis B vaccine using PLGA microspheres Journal of Controlled Release, 112(2006):35～42.
［3］ 中国药典2005 版. 二部［S］. 2005,592, 附录181.
［4］ 王玉红, 黄贺梅. 某校1999～2004 年乙肝普查及疫苗接种情况分析［J］. 解放军预防医学杂志,2005,23(2):34～35.
作者单位：吉林医药设计院，吉林 长春 130021； 吉林大学药学院，吉林 长春 130021； 长春生物制品研究所，吉林 长春 130062.