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【摘要】 目的 在全自动生化分析仪上，应用速率法检测葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（G6PD）的活性和葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（G6PD）/6－磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGD)比值，并建立相应参考范围。 方法 在7600全自动生化分析仪上采用速率法对82例健康的全血样本进行总G6PD和6PGD检测。 结果 总G6PD、6PGD、G6PD和G6PD/6PGD的参考范围分别为17.86±4.84、11.45±3.06、6.41±2.96和0.56±0.24。 结论 应用全自动生化分析仪检测G6PD和G6PD/6PGD，与传统手工法相比，快捷、准确、简便，又能减少试剂用量，降低成本，适用人群的大规模的筛查。
【关键词】 葡萄糖－6－磷酸脱氢酶 6－磷酸葡萄糖酸脱氢酶 速率法 全自动生化分析仪
Determination of G6PD and G6PD/6PGD on auto analyzer.
HUANG Hai-ying，CHEN Bo，HUANG Jun-jian.
(The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College，Guangzhou 510260，Guangdong, P. R. China)
Abstract：Objective To evaluate the results of determination of activity of G6PD and G6PD/6PGD auto-bioanalyzer for establishment of reference range. Methods The total activity of G6PD and 6PGD of 82 samples of whole blood was determined by the rate method on the 7600 auto-bioanalyzer. Results The reference ranges of total G6PD,6PGD,G6PD and G6PD/6PGD were17.86±4.84,11.45±3.06,6.41±2.96 and 0.56±0.24. Conclusion Determining the total G6PD and 6PGD activity on the 7600 auto-bioanalyzer is not only simple,accurate and quick,but also it can also reduce the reagent dosage and the overall cost and thus it is suitable for large-scale screening.
Key words：Glucose-6-phoshate dehydrogenase(G6PD); 6-glucose-phosphate dehydrogenase(6PGD); Rate method; Auto-bioanalyzer
红细胞葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏是溶血性疾病中的常见病，以G6PD基因突变为分子基础的G6PD缺陷症是最常见的X连锁遗传病,临床上表现为新生儿黄疸、蚕豆病、药物性溶血、感染性溶血和非球形细胞溶血性贫血等疾病，在我国广东、海南等南方地区较为多见［1］。诊断G6PD缺乏的方法很多，其中G6PD活性检测是一种较为常用的定量检测方法，手工法居多［2］，操作起来比较费时、费力，人为因素引起的误差较大。目前，利用检测G6PD和6PGD活性之定量比值与G6PD进行临床诊断，进一步提高准确率。随着大型自动化分析仪的出现，使G6PD和G6PD/6PGD测定变为可能，根据酶法的测定原理，在传统手工方法的基础上，用速率法分别检测总G6PD和6PGD，两者相减求得G6PD活力和G6PD和6PGD活性之定量比值。本研究拟探讨采用全自动生化分析仪速率法检测G6PD和6PGD活性的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 检测对象 标本来自广州医学院第二附属医院卫防科健康体检人群等日常送检的柠檬酸钠抗凝静脉血标本82例。
1.1.2 仪器和试剂 7600全自动生化分析仪（日立公司生产，日本） 电子分析天平（型号：240A，瑞士） LDZ5-2低速自动平衡离心机（北京医用离心机厂生产） G6PD试剂盒（RANDOX公司提供，英国，LOT ：067126）包括G6P干粉（R1）、NADP干粉（R2）、Buffer液、溶血素 6－PGANa3(SIGMA公司生产,LOT:121K3780) 、血红蛋白测定试剂盒（上海荣盛生物技术有限公司生产，LOT:20051018）
1.2 方法
1.2.1 原理：
G6P+NADP+G6PD6－磷酸葡萄糖－δ－内酯+NADPH
6-PGA+NADP+6PGD核酮糖-5-磷酸+ NADPH
1.2.2 试剂配制 总G6PD：R1 NADP干粉+60.0ml Buffer液；R3 G6P干粉+6.5ml Buffer液+56.9mg 6PGA Na3干粉。6PGD ：R1 NADP干粉+60.0ml Buffer液+61.4mg 6PGA Na3干粉；R3为空白［5］。血红蛋白测定试剂：25.0ml文齐氏液+5.0ml Triton X-100 ，并加H2O至2 500ml，混匀，置棕色瓶内贮存。
1.2.3 参数设置：
1.2.3.1 总G6PD:Rate A、Reaction Time:10、Temperature:37℃、Assay Point:18～22，Sample Volume:Normal 6μl,Decrease 3μl,Increase 10μl、Reagent Volume:R1 250μl,R3 25μl、Wavelength:340、ABS Limit 32000、Unit:U/L、K Factor:7529。
1.2.3.2 6PGD: Assay Point: 12～16，其余设置同G6PD。
1.2.3.3 Hb: Reaction Time:10、Temperature:37℃、1 Point、Sample Volume:4μl、Reagent Volume:R1 200μl、Wavelength:546、Unit:g/L。
1.2.4 溶血液的配制 2ml静脉血与0.2ml枸椽酸盐抗凝剂混匀后，3 000r/min离心10min，吸取0.06ml压积红细胞于试管中，加入5ml生理盐水，震荡混匀，3 000r/min离心10min，弃去上清液，重复此步骤3次，弃尽上清液，加入0.5ml的毛地黄皂苷溶血液，振荡混匀，置4℃冰箱中静置15min后，3 000r/min离心10min。
1.2.5 检测过程 溶血液配制好后立即上机检测［6］。在7600全自动生化分析仪监测反应过程，10min共读取34点吸光度（第26、27点不读），每点间隔为18s。
1.2.5.1 速率法检测总G6PD和6PGD：检测总G6PGD的通道，反应至第18点～第22点为△A2′；检测6PGD的通道，反应至第12点～第16点△A1′。
1.2.5.2 Hb的检测：使用“终点法”，测出从第33点到34点的吸光度值，算出其相应的浓度（g/L）。
1.2.6 计算：
G6PD（U/L）=K×△A
K=TV/SV×1000/eL=281/6×1000/（6.22×1）=7 529
G6PD（U/g）= G6PD（U/L）/Hb(g/L)
TV：总反应体积μl；SV：样本体积μl；e：在340nm波长时NADPH的毫摩尔吸光系数；L：光径为1cm。
1.2.7 统计学处理 所用软件为Excel。
2 结果
2.1 两种方法酶促反应曲线 速率法检测总G6PD和6PGD时，试剂加入时间相同，不同的是总G6PD检测点为第18～22点（见图1）；6PGD检测点为第12～16点（见图2）。
图1 速率法检测总G6PD反应曲线图（略）
图2 速率法检测6PGD反应曲线图（略）
2.2 参考范围 在全自动生化分析仪上对82例标本进行总G6PD和6PGD检测，G6PD=总G6PD-6PGD得出，计算G6PD和6PGD比值，结果如下，见表1。
表1 总G6PD、6PGD和G6PD的检测结果（略）
3 讨论
在国内诊断G6PD缺乏的方法较多，以往多采用高铁血红蛋白还原试验，荧光斑点法检测G6PD，但准确度差、敏感度低、容易漏诊［3］；G6PD定量法简单，价格低廉，适宜在基层医院开展，但准确性相对较差，存在着假阳性或假阴性；基因法检测准确性高，是一种灵敏、特异而快速的诊断技术，但需要一定的技术和设备；手工法直接检测G6PD活性虽较准确，但操作步骤多，费时费力，精确度差［2，3，7］ 。本文以手工法检测G6PD活性为基准，在7600全自动生化分析仪上采用速率法分别检测总G6PD和6PGD活性，计算出G6PD的活性和G6PD/6PGD比值，简便、快捷。
目前，商品化G6PD检测试剂盒的原理是红细胞内G6PD催化葡萄糖－6－磷酸（G6P）氧化成6－磷酸葡萄糖－δ－内酯，后者很快氧化成6－PGA，同时氧化型辅酶Ⅱ（NADP+）被还原成NADPH，在340nm处测定NADPH的生成量，计算G6PD的活力。然而红细胞内还含有6－磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6－PGD），催化6－PGA脱羧，生成核酮糖－5－磷酸（P－5－P），可同时使NADP+还原为NADPH，故由（6－PGA＋G6PD）组成的底物系统测得的活力，减去单独6－PGA底物测得的活力，才代表真正的G6PD活性［2］，故需要进行6PGD 校正，才能求得真正的G6PD活性。本次实验先测定总的G6PD和6PGD活性，再计算出G6PD的活性和G6PD/6PGD比值。
全自动化分析仪测定G6PD活性，反应量微，试剂用量少，样本量小，在10多分钟出结果，适用大规模的筛查，既可以检出G6PD缺乏患者又可以检出杂合子。由于6PGD缺乏极为罕见，利用6PGD活性作对照，可放大G6PD活性部分减少时的显色差别，减少因标本处置不当带来的误差，如标本放置时间过长、抗凝剂比例不当等［5］。如果只需G6PD/6PGD的比值，测定时无需测定Hb，因此，本次实验测定G6PD和G6PD/6PGD。两者结合起来相得益彰、优势互补、综合判断，可减小误差，进一歩提高筛查敏感性与诊断准确性,避免发生漏诊［8］。
本实验将总G6PD和6PGD酶活性测定应用到7600全自动生化分析仪上，采用双速率法检测，占用两个通道，计算出G6PD的活性和G6PD/6PGD比值。该方法可取代传统手工的检测，做到省时省力、准确、简便、快捷；同时，减少了试剂用量，检测成本降低，可作为一种对G6PD缺陷的诊断具有快速、灵敏的特点,同时可以筛查杂合子,适用于人群的大规模的筛查,尤其适用婚前、产前及新生儿筛查，值得在临床上应用推广。
【参考文献】
［1］ 罗桂英，李招金，毛江洪. 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶定量比值法的临床应用［J］.江西医学检验，2003，21（2）：97～98.
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［8］ 蔡宗友，霍金平，胡定波，等.应用荧光斑点法和比值法检测G6PD［J］.中国优生与遗传杂志，2005，13(4)：80～81.
作者单位：广州医学院第二附属医院检验科, 广东 广州 510260； 广州医学院2006届毕业生，广东 广州 510000.