点击显示 收起
【摘要】 目的 探讨通过检测血清CagA抗体鉴定幽门螺杆菌高毒株感染的可行性。 方法 采集本地区临床门诊行胃镜检查的胃活检标本，作病理检查和幽门螺杆菌（Hp）培养，同时采集病人的血清。采用PCR法检测分离所得的Hp cagA基因，用EIA法测定患者血清CagA抗体，分析cagA基因的检出与消化性疾病的关系，比较cagA基因与CagA抗体的检测结果，评价应用CagA抗体检测Hp高毒株感染的可行性。 结果 分离获得80株Hp，其中54株检出cagA基因，阳性率为67.50%。各病理类型胃病患者cagA基因阳性率分别为：浅表性胃炎 77.42%，萎缩性胃炎 62.86%，胃溃疡58.33%，胃癌50.00%，各组间无显著差异（P>0.05）；EIA法检测CagA抗体的阳性率为55.00%，敏感度为74.07%，特异度为84.62%，约登指数（Youden's index）58.69%，调整一致性77.68%。 结论 检测血清CagA抗体用于诊断高毒力Hp感染存在局限性。
【关键词】 幽门螺杆菌 细胞毒素相关基因A 抗体 酶免疫检测
Evaluation of results of identification of high virulent Helicobacter pylori strains by detection of serum CagA Antibodies.
LI Neng, LI Ni.
(Department of Pathogen Biology, Basic Medical College, Fujian Medical University, Fuzhou 350004, Fujian, P. R. China)
Abstract：Objective To evaluate the feasibility of identification of high virulent strains of Helicobacter pylori by detection of serum CagA antibodies. Methods Gastric mucosa biopsy specimens by gastroscopy in outpatient departments in this area were collected for pathologic examination and culture of Helicobacter pylori, while the sera of same patients were collected simultaneousely. Hp cagA genes were isolated and tested by polymerase chain reaction and serum CagA antibodies were detected by enzyme immunoassay(EIA). The feasibility of identification of high virulent strains of Helicobacter pylori carried out by detection of serum CagA antibodies . The relationship between detection of cagA gene anddigestive diseases was analyzed and the results of detection of cagA genes and CagA antibodie were also compared. Results There 80 Hp strains were isolated from patients wherein 54 strains possessed cagA gene. Total positive rate of cagAgene was 67.50%. The positive rates of cagA gene in various pathological types of gastropathy patients were as follows: superficial gastritis 77.42%, atropic gastritis 62.86%, gastric ulcer 58.33%, gastric carcinoma 50.00%, respectively (P>0.05). The total positive rate of CagA antibodies detected by EIA was 55.00%, while the sensitivity, the specificity, Youden's index and the adjusted agreement were 74.07% , 84.62%, 58.69% and 77.68%, respectively. Conclusion Detection of serum CagA antibodies for diagnosis of high virulent Hp infection has its limitation.
Key words：Helicobacter pylori; Cytotoxin associated gene A; Antibodies； Enzyme immunoassay (EIA)
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是引起慢性胃炎、消化性溃疡等疾病的主要病因，并与胃癌、MALT淋巴瘤的发生密切相关［1］。Hp感染呈全球分布，在人群中感染率高［2］。Hp感染后是否导致炎症以及溃疡的发生与其毒力因子密切相关［3］。因而，进行高毒力菌株的鉴定，对于临床诊断及是否需要进行Hp根除性治疗具有极其重要的指导意义。cagA是Hp主要毒力基因之一，与慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌的发生密切相关［4］。CagA抗体检测对应用于临床检测高毒力菌株的感染，从而反映消化性疾病的发生及其严重程度，目前尚无定论。本研究拟采集胃活检标本，作病理检查和Hp培养，同时采集病人的血清。经Hp cagA基因和患者血清CagA抗体的检测，分析cagA基因的检出与消化性疾病的关系，比较cagA基因与CagA抗体的检测结果，评价应用CagA抗体检测Hp高毒株感染的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 收集临床标本 于2005～2006年收集本校附属第一医院和附属协和医院门诊行胃镜检查患者的标本，包括活检胃组织标本和血清标本，同时收集患者的临床资料（性别、年龄、临床诊断、既往消化道疾病史）。活检标本取胃窦部粘膜组织，一份送病理室作病理检查，一份置于0.5ml布氏培养液中用于细菌分离培养。同时抽取相应病人外周静脉血5ml，离心收集血清，分装后-20℃保存备用，用于检测血清抗体。
1.1.2 标准幽门螺杆菌菌株 标准菌株Hp NCTC 11637购自中国疾病预防控制中心传染病研究所。
1.1.3 Hp cagA和16s rRNA引物设计 根据Genebank公布的Hp cagA和16s rRNA序列，经同源性分析，以Vector NTI 9.0软件设计cagA 开放读码框架内引物CF/CR 和16s rRNA引物16F/16R，引物由上海博亚生物技术有限公司合成。引物序列如表1。
表1 引物及其序列基因（略）
1.1.4 主要试剂盒 快速尿素酶检测试剂盒(福建省三明市三强公司产品)。CagA-Hp IgG EIA Kit试剂盒(上海晶莹生物技术有限公司产品)。
1.1.5 主要仪器设备 厌氧工作站Bugbox-Microaerophilic System：英国RUSKINN公司。
1.2 方法
1.2.1 细菌分离培养及鉴定 取胃镜活检组织用匀浆器磨碎,涂布于含5％脱纤维兔血的布氏培养基上，置于厌氧工作站Bugbox-Microaerophilic System 中37℃微需氧饱和湿度环境（5%O2，10%CO2，85%N2）下培养3～5d。培养产物经快速尿素酶试验、涂片染色镜检初步鉴定。
1.2.2 模板DNA的制备 初步判断为幽门螺杆菌者，刮取细菌置50μl灭菌双蒸水中，100℃水浴10min，8 000g离心5min，取上清以获得细菌DNA，-20℃保存备用。
1.2.3 Hp临床分离菌株16s rRNA基因PCR鉴定 将初步鉴定为幽门螺杆菌的临床分离株DNA进行16s rRNA基因PCR检测，阳性者确定为幽门螺杆菌。PCR反应体系：PCR反应总体积25μl。包括10×PCR缓冲液2.5μl，dNTP（10mmol/L）0.5μl，上游引物16F 0.75μl，下游引物 16R 0.75μl，模板5μl，Taq DNA Polymerase（5u/μl）0.5μl，高压灭菌双蒸水15μl。反应程序：94℃ 5min→(94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min)×40→72℃ 5min。
1.2.4 Hp临床分离菌株cagA基因PCR检测 PCR反应体系：PCR反应总体积25μl。包括10×PCR缓冲液2.5μl，dNTP（10mmol/L）0.5μl，上游引物CF 0.75μl，下游引物 CR 0.75μl，模板DNA 5μl，Taq DNA Polymerase（5u/μl）0.5μl，高压灭菌双蒸水15μl。反应程序：94℃ 5min→(94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1.5min)×30→72℃ 5min。
1.2.5 血清CagA抗体测定 通过酶免疫检测技术测定患者血清CagA抗体。血清样品处理与检测按照试剂盒使用方法专人操作。应用酶标仪，在450nm波长测定血清样品及阳性、阴性对照OD值，计算各血清样品CagA抗体浓度。
1.2.6 统计学方法 用SPSS for windows 13.0软件，采用χ2检验比较样本率之间的差异，以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著。
2 结果
2.1 胃活检标本Hp的分离培养及鉴定 分离培养的细菌，经快速尿素酶试验，涂片染色镜检和16s rRNA PCR鉴定，共分离出80株Hp。
2.2 Hp临床分离株cagA基因检测结果 80株临床分离的Hp中54株为cagA基因阳性，阳性率67.50%。CagA阳性菌株中24例浅表性胃炎，22例萎缩性胃炎，7例消化性溃疡，1例胃癌。cagA基因检测结果及对应的病理诊断结果如表2。各组病理类型之间的cagA基因阳性率经χ2检验均P>0.05。
表2 各种类型胃病患者Hp cagA基因检测结果（略）
2.3 血清CagA抗体检测与cagA基因检测结果比较 比较血清CagA抗体与cagA基因检测结果，如表3。结果显示，χ2=4.50，P<0.05。CagA抗体检测的阳性率为55.00%（44/80），敏感度为74.07%（40/54），特异度为84.62%（22/26），约登指数（Youden's index）58.69%，调整一致性77.68%。
表3 CagA抗体检测与cagA基因检测结果比较（略）
3 讨论
目前对于Hp感染的诊断可以分为两种：即侵入性检查和非侵入性检查。侵入性检查主要是通过胃镜取胃粘膜标本作快速尿素酶诊断、细菌培养、PCR和组织学检查；非侵入性检查包括血清抗体的检测、尿素呼气试验、粪便抗原检测等。因侵入性检查造成的创伤性，尤其不能被儿童所接受，故而非侵入性检查更多受到青睐［5］。但是这些非侵入性的检查方法，如尿素呼气试验、粪便抗原和血清UreB抗体检测仅是对Hp感染进行诊断，不能对高毒株进行鉴定。
cagA和vacA是目前研究最多的Hp多态性毒力基因，根据Hp是否产生VacA和CagA蛋白将其分为Ⅰ型和Ⅱ型菌：Ⅰ型菌产生VacA和CagA蛋白，为高毒力菌株，与慢性胃炎、消化性溃疡等疾病的发生密切相关；Ⅱ型不产生CagA和VacA蛋白，为低毒力株［6］。cagA基因是Hp cag毒力岛的标志，研究发现具有cagA基因Hp感染者较无cagA基因Hp感染者有更明显的胃炎和胃上皮损伤。胃粘膜中IL-1a、IL-1和IL-8表达更高，IL-8能引起中性粒细胞在胃粘膜中浸润，加重粘膜炎症反应的损伤程度，引起上皮结构丧失继之发生萎缩和肠化生最终发展为胃癌［7,8］。然而，越来越多的流行病学调查发现，CagA阳性菌的感染率极高，在西方国家约占60％～80％［9］。亚洲感染率更高［10,11］，我国有些地区甚至达到90%以上［12］。日本Park等［10］和韩国Ogura等［11］的报告更进一步显示含cagA基因的Hp菌株在亚洲地区的存在与宿主的疾病种类无明显相关。Lazebnik LB等的研究也提示cagA+ vacA s1 感染率高，很难确定其与疾病的关系［13］。本研究利用PCR方法调查了本地区80株临床门诊来源的幽门螺杆菌菌株cagA基因类型，研究结果显示在全部80株Hp菌株中cagA基因的阳性菌株为54株(阳性率67.50 %)，不同严重程度的宿主胃病病理类型之间cagA基因阳性率无显著差异，即cagA基因与消化性疾病的严重程度无相关性，也验证上述观点。cagA基因及其编码产物的确切作用及其在Hp致病中的地位，尚需进一步的探讨。目前至少可以认为CagA可能是一种重要的毒性标记,但并非疾病的特异性标记。此外Miehike等研究显示Hp的cagA基因序列可能存在地理分布的差异［14］。因此我国各地区Hp感染菌株是否亦存在上述差异，值得进一步研究。
目前检测血清CagA抗体是诊断高毒力Hp感染常用的方法。研究发现，具有cagA基因的Hp几乎都能表达CagA蛋白,并能产生可以测出的CagA抗体，血清CagA抗体阳性与Hp cagA基因存在非常密切的关系［15］。但该方法始终存在敏感性和特异性不高的问题，其作为毒力菌株的鉴定方法值得商榷［16］。本研究小组以往的试验结果显示，检测56份Hp感染者血清CagA抗体，敏感度和特异度均小于72%［17］。本研究中，80株临床分离的Hp，检出cagA基因阳性率为67.50%，而CagA抗体检测阳性率只有55.00%，抗体检测的敏感度和特异度分别为74.07%和84.62%，约登指数（Youden's index）58.69%，调整一致性77.68%，以上指标均偏低显示检测血清CagA抗体用于诊断高毒力Hp感染存在局限性，不能准确反映患者感染的Hp毒力情况。考虑受如下因素影响：cagA基因具有高度多态性, 随地区、人群的改变具有不同的型别［14］。CagA-Hp IgG EIA Kit试剂盒所采用的CagA抗原蛋白并不一定是PCR所检测到的cagA基因所编码的蛋白。应以从胃内分离单一菌株,并对cagA基因分段测序［18］。另外，血清学检测虽然可以反映CagA阳性菌株感染的情况，但同时也会受机体的免疫状态的影响，当机体免疫功能较低时亦可能出现假阴性的结果。
综上所述，以检测CagA来反映毒性Hp的感染情况，已不能很好地满足临床的需要，加上目前的检测试剂盒敏感性和特异性不甚理想，极大影响了临床上的广泛应用。而寻找新的检测指标，揭示更具特征性的毒力因子，将是有效诊断高毒力Hp感染的出路。
【参考文献】
［1］ Goodwin CS, Medall MM, Northfield TC, et al. Helicobacter pylori infection［J］. Lancet, 1997,349:265～269.
［2］ Li YY, Hu PJ, Du GG, et al. The prevalence of Helicobacter pylori infection in P. R. China［J］. Am J Gastroenterol, 1991,81:446～449.
［3］ 刘文忠.幽门螺杆菌研究进展［M］.上海:上海科学技术文献出版社,2001,12～25.
［4］ Tham K T,Peek R MJr,Atherton J C, et al.Helicobacter pylori genotypes,host factors,and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease［J］.Hum-Pathol,2001,32(3):264～273.
［5］ Iwanczak F,Pytrus T,Iwanczak B,et al.Assessment of selected tests in diagnosis of Helicobacter pylori infections［J］.Pol Merkuriusz Lek,2005,19(109):52～56.
［6］ Morales TG, Sampliner RE, Bhattacharyya A. Intestinal metaplasia of the gastric cardia［J］. Am J Gastroenterology,1997,92(3):414～418.
［7］ Crabtree J E, Farmery S M, Lindley I J D,et al.CagA/ cytotoxic strains of Helicobacter pylori and interleukin-8 in gastric epithelial cell lines［J］. J ClinPatho,1994,47:945.
［8］ Blaser MJ, Perez-Perez GI, Kleanthous H, et al. Infection with Helicobacter pylori strains possessing cagA is associated with an increased risk of developing adenocarcinoma of the stomach［J］. Cancer Res, 1995,55(5):2111～2115.
［9］ Crabtree JE, Taylor JD, Wyatt JI, et al. Mucosal IgA recognition of Helicobacter pylori 120 kDa protein, peptic ulceration, and gastric pathology［J］.Lancet,1991,338:332～335.
［10］ Park SM, Park J, Kim JG, et al. Infection with Helicobacter pylori expressing the cagA gene is not associated with and increased risk of developing peptic ulcer disease in Korean patients［J］. Scand J Gastrenterol,1998,33:923～927.
［11］ Ogura K, Kanai F, Measa S, et al. High prevalence of cytotoxin positive Helicobacter pylroi in patients unrelated to the presence of peptic ulcers in Japan［J］. Gut, 1997,41:463～468.
［12］ 朱永良,杜勤,钱可大,等. 幽门螺杆菌CagA C 端功能域特征及其生物学功能研究［J］. 中华消化杂志,2004,24 (5):278～281.
［13］ Lazebnik LB,Tsaregorodtseva TM,Serova TI,et al.Antibodies to Helicobacter pylori in gastric diseases［J］.Ter Arkh,2006,78(2):15～19.
［14］ Miehike S, Kibler K, Kim JG, et al.Allelic variation in cagA gene of Helicobacter pylori obtained from Korea compared to the United States［J］. Am J Gastroenteral, 1996,91:1322～1325.
［15］ Cover TL,Glupczynski Y,Lage AP, et al. Serologic detecion of infection with CagA+ Helicobacter pylori strains［J］. J Clin Microbiol,1995,33:145～150.
［16］ Suriani R, Venturini I,Colozaa M. Helicobacter pylori antibodies (CagA and VacA) detection.The link between cancer and infection［J］.Minerva Gastroenterol Dietol,2002,48(2):159～164.
［17］ 张静，陈月秀，佘菲菲，等.幽门螺杆菌cagA M1＇基因表达抗原的纯化及应用［J］.中国人兽共患病杂志,2005,21(6):495～498.
［18］ 陈世耀，刘建军，王吉耀，等.血清幽门螺杆菌CagA蛋白抗体滴度与消化性溃疡的关系［J］. 胃肠病学和肝病学杂志,1999, 8 (4):265～266.
作者单位：福建医科大学基础医学院病原生物学系,福建 福州 350004.