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【摘要】 目的 探讨胰岛素样生长因子-I（IGF-I）在慢性阻塞性肺疾病（COPD）小气道的表达与平滑肌增厚、粘膜下层胶原沉积等导致气道重构的关系。 方法 制备COPD Wistar大鼠模型10只，正常对照组10只，用免疫组织化学方法显示IGF-I在小气道的表达，用HE染色及masson三色染色显示气道平滑肌；用图像分析仪对IGF-I进行定量分析。 结果 COPD组IGF-I在小气道上皮细胞、粘膜下层、平滑肌层的表达均较对照组显著增高（P＜0.01），地塞米松有一定的抑制作用（P＜0.05）;细支气管肺组织IGF-I表达与最大呼气流量(PEF)和0.3s用力呼气容积(FEV0.3)及FEV0.3/FVC(%)显著负相关，r值分别为-0.496（P＜0.05），-0.487（P＜0.05），-0.707（P＜0.01）。IGF-I表达与小气道管壁厚度明显相关，r值为0.772（P＜0.01）。 结论 COPD大鼠小气道存在气道重构及在小气道上皮细胞、粘膜下层及平滑肌层均有较丰富的IGF-I的表达，显示IGF-I在 COPD小气道重构中起揭示作用及地塞米松对COPD小气道重构有预防作用。
【关键词】 胰岛素样生长因子-I 慢性阻塞性肺疾病 气道重构
Significance of insulin like growth factor-I express in small airway remodeling of rats with chronic obstructive pulmonary disease.
WU Zhi-yong, DAI Wen-xin.
(The Rehabilitation and Medical Centre of Hainan Provincial People’s Hospital, Haikou 570311, Hainan, P. R. China)
Abstract：Objective To assess whether insulin- like growth factor-I(IGF-I), a fibrogenic growth factor, involves in airway wall remodeling in chronic obstructive pulmonary disease(COPD). Methods The male Wistar rats, weighed 280+20g, were divided into tree groups: COPD group (n=10),normal control group(n=10).Expression of IGF-I were identified using immunohistochemistry on paraffin slides. Smooth muscles were identified using H-E stain and Masson ’s trichrome stain. Masson’s trichrome stain also used to determine collagen deposition in the small airways. The following parameters with a computerized image analysis system were measured in small airways cut in reasonable cross-sections. IGF-I was quantitatively analyzed. Results 1.Smooth muscle and collagen: Small airway wall thickness were prominent increased in COPD group (P<0.01).； 2.The negative correlationswere observed between the levels and lung function parameters: In small airway, the expression of IGF-I was correlated negatively with PEF (r=-0.496, P<0.05),FEV0.3 (r=-0.487,P<0.05) and FEV0.3/FVC(%) (r=-0.707,P<0.01). The positive correlation was observed between the expresson of IGF-I and small airway wall thickness (r=0772, P<0.01). The negative correlation was observed between the expression of IGF-I and FEV0.3/FVC(%) (r=-0.511, P<0.01). Conclusion Chronic exposure to cigarette smoking and intratracheal administration of porcinepancreatic elastase (PPE) can result in COPD in experimental rats. Airway remodeling was founded in small airway of COPD rat model.IGF-I may play an important role in the airway remodeling of COPD.
Key words：Insulin- like growth factor-I；Chronic obstructive pulmonary disease;Airway remodeling
慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD）是一种具有气流 受限为 特征的可以预防和治疗的疾病，气流受限不完全可逆，呈进行性发展，与肺部对香烟烟雾等有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。COPD与慢性支气管炎和肺气肿密切相关［1］。COPD发病机理尚未完全清楚。目前的气道和肺部炎症，蛋白酶/抗蛋白酶失衡，氧化/抗氧化失衡等学说均无法完全解释该疾病的肺功能呈进行性下降及病理生理变化的特点，因此迄今尚无有效的药物能根本上防治COPD。近年来，人们逐渐认识到气道重构在COPD发病过程中的重要性，积极探索气道重构发生机制是预防COPD的关键［2］。生长因子是一类调节细胞有丝分裂增殖的活性多肽［3］，近年来生长因子在气道重构中所发挥的作用日益受到关注。作为生长因子的IGF-I，近些年成为研究气道重构的新靶点。
1 材料和方法
1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠20只(中南大学实验动物中心提供)，鼠龄12W，体重(280±20)g，SPF级,饲养于普通级实验室。
1.2 方法
1.2.1 建立COPD动物模型和分组 20只健康雄性大鼠，随机分为健康对照组和COPD模型组。健康对照组(10只)置于室内正常喂养，第30d气道内注射生理盐水（NS）各0.1ml, 第1～29d，第31～60d腹腔内注射灭菌生理盐水0.5mg/kg 0.3ml，1次/d；COPD模型组（10只）于第1～29d、31～60d每日上午在自制有机玻璃箱内被动吸烟，1次/d，每次0.5h，每次4支，烟熏第30d，用10％水合氯醛（3ml/Kg）腹腔内注射麻醉，仰卧位固定于鼠板上，常规消毒，纵向切开颈部，分离皮下，暴露气管，四号针头穿刺气管，注射入猪胰弹性蛋白酶（PPE）20u／100g配成的0.1ml生理盐水，并注入少量空气以保证全部药液进入气管，立即将鼠板竖起并适度摇动使药液分布尽可能均匀，缝合皮肤，切口消毒，将大鼠置于单独的鼠盒中，注意保温，待大鼠清醒后放回原鼠盒中饲养，继续烟熏至2个月。每天烟熏前0.5h腹腔注射生理盐水0.5mg/kg（0.3ml）,1次每天至造模完成。
1.2.2 模型评价 各组大鼠 均取右肺下叶，在垂直于支气管的肺矢状面最大周径处取材，采用HE染色和Masson染色，观察大鼠肺和气道组织的病理变化。8周后采用湘雅医学院新校区生理教研室的小动物呼吸功能测定仪(宣武医院制)测肺功能。大鼠麻醉后置体描器内,呼吸时体描器的容积变化经处理可计算出潮气量及每分钟呼气量(VE),经自制面罩外加25cmH2O(1cmH2O=0.098kPa)的压力,迫使动物深吸气,再以25cmH2O的负压吸引,造成深呼气,能较准确地测出最大呼气流量(PEF)和0.3s用力呼气容积(FEV0.3)。以10％的水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，分离气管插入Y形管，Y形管两端分别与流速、压力传感器相连，流速传感器对应端与小动物呼吸机连接。设置潮气量为10ml/kg,呼吸频率为60次/min。将流速、压力传感器分别与Maclab数据记录分析系统连接。在描记一段平静呼吸后，在呼气末以注射器经三通管迅速以相当于潮气量5倍的气量充气（相当于深吸气），然后立即脱开，连接负压（-25cmH2O）抽气造成深呼气，所引起的容积变化经微机处理计算出FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC以及PEF［4,5］。
1.2.3 病理标本的制作 以上动物肺功能检测完毕后，剖胸，右心房取血留作血清IGF-I测定用。左肺10%的中性福尔马林25cm水压下灌注固定20min，再浸入福尔马林固定，常规脱水，透明，浸蜡包埋。分别行HE和masson三色染色。
1.2.4 免疫组织化学肺内IGF-1的表达 按试剂盒要求即链霉菌抗生物素蛋白－过氧化酶连接法（S-P）检测IGF-1的表达。
1.2.5 病理图像分析［6］ 应用显微微机图象处理系统，使显微镜处于同一放大倍数，随机对每只大鼠切片选取2～5个较为完整的气道（即短长径比值大于0.5），每组大鼠取约30小气道。HE染色和Masson染色以固定颜色模式界定胶原，色调，饱和度，颜色强度等条件下分别测定:细支气管的外径，管壁厚度（中膜肌层），基底膜周长，气道外周长,直径以及相应的面积，气道外管壁总面积。在masson染色片子上，测定气道壁胶原面积，同样以单位长度的胶原厚度。然后计算管壁厚度与气管外径比值（MT％），管壁面积与气管总面积比值（MA%）。按照参考文献［7］,将气道分为小气道（Pbm<1 000μm）, 中等气道（Pbm 1 000～2 000μm）, 大气道（Pbm）2 000μm）。
1.3 统计学处理 应用SPSS13.0软件系统进行统计分析。两样本均数的多重比较采用LSD-t检验，组间比较用Student-Newman-Keuls法，以α双=0.05为检验标准。相关性用直线回归分析。
2 结果
2.1 病理形态学观察 模型组HE染色显示细支气管纤毛部分脱落、纤毛粘连倒伏、变性坏死，气道上皮复层化，杯状细胞增生；气管粘膜下层、肌层可见大量的淋巴细胞、巨噬细胞浸润，少量浆细胞；小气道周围肺泡区聚集大量吞噬烟尘的“尘细胞”；肺泡腔不规则扩大，特别在肺泡外周明显，可见肺大泡形成；支气管平滑肌层和正常组比较增厚明显，masson三色染色可见细支气管、肺动脉胶原明显增多。正常组呼吸道及肺泡上皮结构完整，纤毛排列整齐，各级气管支气管可见少量散在淋巴细胞浸润，肺泡结构完整无气肿，肺泡区极少见到巨噬细胞。见图1～2。
图1 COPD模型组和正常对照组HE染色病理组织变化（略）
对照组HE×400正常大鼠支气管管壁无炎症细胞浸润，肺泡隔无破坏
COPD模型组HE×400大鼠细支气管管壁大量炎细胞浸润，局灶肺泡隔破坏，肌层增厚，肺气肿形成
图2 COPD模型组和正常对照组masson染色病理组织变化（略）
对照组 masson三色染色×400正常大鼠细支气管，血管胶原含量较少，肌层菲薄，深蓝色代表胶原组织，管壁平滑肌为红
COPD模型组masson三色染色×400模型组大鼠细支气管，血管胶原明显增多，平滑肌增厚
2.2 大鼠肺功能测定 COPD模型组PEF和FEV0.3、FEV0.3/FVC较对照组显著降低（P＜0.05）。
表1 各组呼吸功能的检查结果（略）
注：*表示与对照组比较,P＜0.05。
2.3 细支气管肺组织IGF-I表达 COPD组细支气管肺组织IGF-I的表达明显增多（P＜0.01）。模型组大鼠可见支气管粘膜上皮、肺泡上皮、血管内皮及巨噬细胞强阳性表达IGF-I，而正常对照大鼠表达阴性或弱阳性，见表2和图3。
表2 细支气管肺组织的IGF-I表达相对含量（略）
注：*表示与对照比较,P＜0.01，与COPD组比较,P＜0.05。
图3 COPD模型组和正常对照组IGF-I免疫组化表现（略）
正常对照组大鼠细支气管粘膜上皮细胞，肺泡上皮细胞，少量巨噬细胞弱阳性表达IGF-I 免疫组化×400
COPD模型组大鼠细支气管粘膜上皮细胞，血管内皮细胞，肺泡上皮细胞，巨噬细胞强阳性表达IGF-I 免疫组化×400
2.4 相关分析 最大呼气流量(PEF)和0.3s用力呼气容积(FEV0.3)及FEV0.3/FVC(%)与细支气管肺组织IGF-I表达显著负相关，r值分别为-0.390（P＜0.05），-0.536（P＜0.01），-0.527（P＜0.01）。IGF-I表达与小气道管壁厚度明显相关，r值为0.612（P＜0.01）。
3 讨论
迄今为止，尽管对慢性阻塞性肺病（COPD）的危险因素进行了大量的研究，但其发病机制尚不完全清楚。现认为COPD是以不完全可逆的气流受限为特征的疾病。小气道重构进行性加重，增加了疾病的严重程度［8］。对于COPD气道重构一直是近年来研究的热点问题，并取得了一定的进展。
目前国内多采用宋一平教授的方法制备COPD大鼠模型。由于考虑到脂多糖（LPS）可以引起炎性细胞释放多种生长因子（如TGF-α，IGF-I等），可能影响本实验重要指标的检测；而目前尚无文献报道猪胰弹性蛋白酶影响本实验观察指标IGF-I胶原I和III等；因此我们选择了猪胰弹性蛋白酶取代LPS，按照国外的COPD动物模型的制备方法［9］，采用熏香烟和气管内注入猪胰弹性蛋白酶的方法，制作了COPD大鼠模型。肺和气管的病理学检查和肺功能检查评价结果表明，本试验建立的COPD模型具备人类COPD的病理解剖学特征和病理生理学特征。
IGF-I是一种具有广泛调节多种细胞增殖、分化的细胞生长因子，并且可以抑制细胞凋亡的产生，参与组织的发育及损伤后的修复。既往研究表明胰岛素样生长因子系统与肺发育及肺损伤有关，并通过基因调控、药物干预等方法调节IGF系统的产生及代谢，来达到减轻肺损伤的发生。IGF是肺上皮细胞增殖中带有自分泌和（或）旁分泌活性的促有丝分裂肽，促进肺II型细胞增殖和转化成I型细胞。它也可以引起肺明显的纤维化，促进成纤维细胞合成分泌胶原，抑制胶原的降解，在肺纤维的发生中起重要作用。此外它还可以促进平滑肌细胞增生肥大。本研究结果显示，COPD大鼠小气道IGF-I表达较正常对照大鼠明显增加。COPD大鼠小气道壁组织中的IGF-Ⅰ水平增高，且IGF-Ⅰ增高的水平与小气道壁增厚的程度呈正相关 ，IGF-I表达的强弱与PEF和FEV0.3、FEV0.3/FVC负相关。提示IGF-I在COPD小气道重构中发挥重要作用。IGF-Ⅰ不仅是一种循环激素，同时作为一种重要的局部生长因子，可能通过小气道组织细胞的自分泌和/或旁分泌作用参与COPD大鼠小气道重构的发生和发展的病理生理过程。
【参考文献】
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作者单位：海南省人民医院医疗康复中心二区,海南 海口 570311.