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【摘要】 目的 研究CYP1A1 SNPrs4646903在宁夏地区正常女性人群中的基因型频率和等位基因频率分布特征，并与国内其它人群进行比较,获得该位点人群的遗传学数据。 方法 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术及测序分析对154例宁夏地区汉族女性正常人的CYP1A1 SNPrs4646903分布进行测定,并利用χ2检验比较本地与中国各地人群基因频率分布差异。 结果 SNP rs4646903突变纯合子(CC基因型)、突变杂合子(TC基因型)和野生纯合子(TT基因型)在宁夏人群中的基因型频率分别为11.7%、47.4%、40.9%；SNP rs4646903 T和C等位基因频率在宁夏人群中为64.6%、35.4%,其等位基因和基因型频率分布与中国广州人和河南人群的差异有统计学意义(P<0.05)，但与其它各地的研究结果统计无差异。 结论 中国各地人群CYP1A1 SNP rs4646903基因型频率和等位基因频率分布不同，具有其特有的群体遗传学特征。
【关键词】 CYP1A1；SNP rs4646903；宁夏汉族
Study on the polymorhhism of CYP1A1 SNPrs4646903 in Chinese population.
LIU Chun-lian, GU Ji-wei, PENG Liang, et al.
( 1.Center of Reproductive Medicine, Affiliated Hospital of Ningxia Medical College, Yinchuan 750004, Ningxia, P. R.China)
Abstract：Objective To investigate the distributing features of genetic frequency and allele freqency of CYP1A1 SNPrs4646903 in normal women of Ningxia Hui Nationality Autonomous Region in northern China and compare with other populations for acquisition of hereditary data. Methods The sequence and distribution of CYP1A1 SNPrs4646903 in normal women of 154 Han Nationality in Ningxia Region was determined with polymerase chain reaction-restrictive fragment longth polymorphism (PCR-RFLP) and the indifferences of frequency distribution of gene were compared with the populations in various areas of China Results The distribution of mutant homozigote of (CC genetic type), mutant heterozigote (TC genetic type ) and wild homozigote ( TT genetic type ) of SNPrs4646903 in population in Ningxia Region were 11.7%、47.4%、40.9, respectively; b) The distribution of T and C allele gene frequency of SNP rs4646903 in population of Ningxia Region was 64.6%、35.4%, repsectively; c) The distribution of allele gene and genetic frequecy of CYP1A1 SNPrs4646903 in normal women of Ningxia Region was significantly different from the populations in Guangzhou City and Henan Province in China. Conclusion The distribution of genetic frequency and allele gene frequency of CYP1A1 SNP rs4646903 are different in various areas of China without significant differences but with special populous hereditary features
Key words：CYP1A1；SNP rs4646903；Ningxia Han nationality
人类基因组研究表明不同种族基因背景存在较大差异，这种差异可能造成对疾病易感性的不同，不仅如此，基因背景的异质性，也是导致同一疾病在不同地域和种族间临床表型不完全相同的原因之一。因此，在对一些致病基因多态性进行研究时，首先应该了解其在正常人群中的分布特点，这是正确分析和阐述基因多态性研究结果的前提。
细胞色素P450 超家族是机体重要的I项代谢酶系。其中CYP1A1广泛分布于肺、肾、皮肤、喉、胎盘、淋巴细胞及脑等肝外组织，在外源物如烃类致癌物的代谢中CYP1A1占2.5%,通过呼吸或饮食进入体内，最终代谢为活性中间物而致癌。已发现CYP1A1有4种多态性位点，由于SNP rs4646903(3801T→C)多态性位于非编码区，人们曾认为该突变所产生的生物学作用可能是由于与其它编码区或芳烃受体连锁引起的，因此目前有大量的关于该SNP与各种疾病的病例－对照研究报道，但结果不相一致。本研究通过PCR扩增、电泳及测序检测，分析了CYP1A1 SNPrs4646903基因型频率和等位基因频率在宁夏汉族女性人群中的分布，探讨中国部分地区人群基因分布规律，为进一步研究该基因与疾病相关性奠定基础，现报告如下。
1 对象与方法
1.1 对象与材料
1.1.1 对象
于2005年5月～2006年8月，收集宁夏医学院第一附属医院的健康体检女性154例(30～70)岁，平均年龄(52.69±11.2)岁。所有研究对象均无慢性病史、无放射和化学药物治疗史、无自身免疫性疾病史；研究对象均为在宁夏地区生活15年以上且无血缘关系的长住居民。以上研究对象为排除PCR扩增失败的样本。
1.1.2 材料
资料来源 通过对《中国生物医学文献数据库》检索、文献追溯、手工检索等途径收集国内1991～2007年公开发表的有关文献资料25篇。文献资料入选标准 (1)1991～2007年国内发表的独立的病例对照研究；(2)研究方法相似；(3)汇总的结果可以用相应的统计指标表达。根据以上标准，经筛选符合标准的文献共有20篇［2～21］， 研究对象共计2 914例。
1.2 实验方法
1.2.1 提取外周血DNA
抽取静脉血3～5ml, EDTANa2抗凝，低渗溶血法分离白细胞,酚、氯仿法提取基因组DNA ,并用乙醇沉淀,溶解于保存液(TAE)中(浓度为0.1mg/L),置-4℃冰箱保存。
1.2.2 CYP1A1 SNPrs4646903检测引物设计
引物［22］由北京赛百盛技术有限公司合成。上游：5’-TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT-3’，下游：5’-AGCGGCTACACCTCTTCACTG-3’。上下游引物（各5OD）分别加去离子水228.8μl及262.6μl配置成1μl/L备用。PCR扩增反应体系总体积为25μl，包括10pmol/μl的引物溶液各1.25μl，4×dNTP(含各种dNTP 2.5mmol/L)溶液2.0μl,10×Buffer2.0μl, 5mmol/L Mgcl2溶液1μl，Tag酶1U（购自华美生物工程公司）0.5μl，基因组DNA溶液2.0μl，再加去离子水至25μl配成反应体系。应用Bio-Rad公司的PE2400 PCR仪进行基因扩增。反应条件为94℃预变性5min，循环周期依次为解链94℃ 35s，退火60℃ 35s，延伸72℃ 60s，33个循环周期后72℃再延伸7min。1%琼脂糖凝胶电泳，检测PCR扩增产物片段为343bp。置-4℃冰箱保存待用。PCR扩增产物10μl，MspI(Promega)0.5μl(10u),10×buffer 2.0μl，BSA 2.0μl,用去离子水补足至20μl，37℃水浴,转摇40转/min，消化4h。2%琼脂糖凝胶电泳40min。酶切结果经电泳后，于紫外灯下判定其基因型，CYP1A1 SNP rs4646903野生纯合子（TT）显示为343bp一条带；杂合突变子（TC）为343bp、200bp、143bp三条带；纯合突变子(CC)为200bp、143bp两条带。另取TT和CC的PCR扩增样本各3例送测序，检验基因分型的准确。
1.2.3 统计学处理
采用SPSS11.5软件对所得数据进行统计分析。测得的基因型、等位基因频率与Hardy-Weinberg平衡的符合程度采用卡方检验。
2 结果
2.1 酶切结果经电泳后，于凝胶成像系统摄影记录，以直接计数法分别统计各基因型的个数。
2.2 测序
经PCR-RFLP筛选出野生型和纯合突变型PCR扩增各3例，并由北京利嘉生物公司测序，结果CYP1A1 SNPrs4646903野生型基因测序3801处碱基为“T”，而纯合突变型基因测序3801处碱基“T”被“C”替代，测序结果显示为“C”。
2.3 CYP1A1 SNPrs4646903 PCR扩增产物电泳图
见图1。
2.4 群体代表性检验
研究对象的CYP1A1 SNPrs4646903基因型分布经χ2检验，P>0.05 ,符合Hardy-Weinberg平衡, 表明研究对象来自同一群体，具有较好的代表性。
2.5 CYP1A1 SNPrs4646903等位基因频率及基因型频率在的中国部分地区的分布情况及其与宁夏汉族女性相比较的研究结果见表1。表1 CYP1A1 SNPrs4646903等位基因频率及基因型频率（略）注:#与宁夏人群相比无统计学意义，P>0.05;*与宁夏人群相比有统计学意义，P<0.05。
由表1可见，宁夏地区汉族人群CYP1A1 SNP rs4646903的等位基因和基因型频率与中国广州人群和河南人群的频率分布有显著性差异(P<0.05)，但与其它各地的研究结果一致。
3 讨论
CYP1A1酶由CYP1A1编码, 该基因位于15q22～24, 含7个外显子和6个内含子，目前已发现4个重要的多态性位点。其中SNP rs4646903(CYP1A1*2A)，位于CYP1A1 3’端非翻译区，由3801T→C（多聚A位点下游约264bp）突变所引起。除野生型纯合子TT，突变型杂合子TC和突变型纯合子CC均具有MspI识别的酶切位点。单核苷酸多态性(SNP)大约1 000～2 000碱基对发生一次，是由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单个碱基的转换、颠换，其中次要等位基因频率不应小于l%。使得SNP可以成为CYP1A1的遗传标志。不仅如此，人类的遗传差异并不仅仅表现在个别多态的水平上，更表现在紧密连锁的一系列等位基因的专一组合(单体型)。由此，就有可能通过密集的SNP来识别常见的单体型并将此与疾病相联系。从实验操作来看，通过SNP发现疾病相关基因突变比通过家系容易；有些SNP并不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记［26］，有助于发现致病基因。
不同种族、地区在遗传背景上的差异可以使人类对疾病具有不同的易感性。现有数据库的资料大多是该SNP与各种疾病的病例－对照研究，目前尚无对其在正常中国人群分布特征的研究，我们将中国宁夏女性汉族人群CYPlAl SNPrs4646903的基因型、等位基因分布频率与部分地区研究结果进行统计比较。中国部分地区的研究结果显示TT基因型频率为20.55%～52.04%, CC基因型为5.26%～38.41%，TC基因型频率分布在32.97%～62.24%。刘振华［23］等人的研究表明中国汉族人该SNP的等位基因频率和基因型频率分布与日本人差异无统计学意义(P>0.5)，但与高加索人群差异有统计学意义(P<0.05)。3种基因型在不同人群中的分布表现出较大的差异。在亚洲人群基因型CC和TC频率分布分别是2%～18%和32%～55%，而在欧洲和美洲白种人群两种基因型的频率则分别是0%～5%和9%～28%［24］。进一步证实了CYPlAl SNPrs4646903的分布存在地区、种族差异。
在分析CYP1A1多态性与疾病相关性时，必然要涉及与对照人群基因型频率的比较，选择不同种族人群为对照、或选择不同来源的对照(医院其他患者、患者的血缘亲属、非血缘亲属、社区自然人群)作为比较的基线时，由于不同特征人群，代谢酶基因突变频率有差异，在比较和分析时，如果未考虑对照人群中这一因素的影响，将很难得到令人信服的结果。己有不少资料描述白人、黑人和日本人群代谢酶基因多态性的分布频率。而在中国人中的研究较少，本文研究结果表明中国部分地区人群该基因频率的分布不一致，其原因可能由于个别研究得 样本量较小、未明确交代是否选用自然人群、人群的民族构成不清、无法判断研究是否存在偏倚及偏倚的方向和大小等。因此中国人代谢酶基因多态性频率的代表性和说服力尚不能令人满意，不能据此结果进行定论。
【参考文献】
目的 研究CYP1A1 SNPrs4646903在宁夏地区正常女性人群中的基因型频率和等位基因频率分布特征，并与国内其它人群进行比较,获得该位点人群的遗传学数据。 方法 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术及测序分析对154例宁夏地区汉族女性正常人的CYP1A1 SNPrs4646903分布进行测定,并利用χ2检验比较本地与中国各地人群基因频率分布差异。 结果 SNP rs4646903突变纯合子(CC基因型)、突变杂合子(TC基因型)和野生纯合子(TT基因型)在宁夏人群中的基因型频率分别为11.7%、47.4%、40.9%；SNP rs4646903 T和C等位基因频率在宁夏人群中为64.6%、35.4%,其等位基因和基因型频率分布与中国广州人和河南人群的差异有统计学意义(P<0.05)，但与其它各地的研究结果统计无差异。 结论 中国各地人群CYP1A1 SNP rs4646903基因型频率和等位基因频率分布不同，具有其特有的群体遗传学特征。
作者单位：1.宁夏医学院附属医院生殖医学中心，宁夏 银川 750004; 2.宁夏医学院附属医院心胸外科，宁夏 银川 750004; 3.宁夏医学院医学遗传学与细胞生物学教研室，宁夏 银川 750004; 4.宁夏回族自治区生殖与遗传重点实验室，宁夏 银川 750004.