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【摘要】 目的 在将目的基因导入靶细胞实现基因治疗的过程中，载体起着关键作用。令人遗憾的是至今仍未能建立一种兼顾安全与高效的载体系统，即使研究应用最广的逆转录病毒载体也不例外，利用重组逆转录病毒介导基因转移弥补及克服传统载体的缺陷，实现安全而高效的基因治疗势在必行。
【关键词】 基因重组;逆转录病毒;基因转移;基因治疗
基因治疗是将特定的基因转入患者特定的靶细胞以最终达到治疗基因紊乱性疾病的治疗方法。载体、转导基因、靶细胞是基因疗法的基本组成元件。随着基因治疗的深入开展，建立安全高效的基因转移载体系统成为至关重要的研究课题。目前应用较多的逆转录病毒、腺病毒、脂质体等载体，虽已取得了一定的实验结果，但都存在一些问题，不同程度地阻碍和延缓了基因治疗的进程。随着基因重组技术及包装细胞系的不断发展，重组逆转录病毒载体已经克服了传统载体的诸多弊端，并初步用于临床试验，期望由其介导的基因转移，特别是在肿瘤的基因治疗方面，探索一条基因水平上的治疗新途径。
1 重组逆转录病毒载体的构建及优势
逆转录载体基因转移系统包括两部分:一部分是用外源基因替代病毒结构基因的逆转录病毒载体,另一部分是基因组中整合了逆转录病毒结构基因的包装细胞，二者功能互补，产生具有感染能力的病毒颗粒。传统的逆转录病毒载体只能感染分裂期细胞，而且转染效率较低，宿主范围窄［1］。为了提高载体系统的安全性和有效性，用三个病毒穿梭质粒分别将带有目的基因的病毒核酸序列、病毒包膜和衣壳基因导入包装细胞，形成重组的具有一次感染性的假型病毒颗粒，病毒包膜基因可选用水泡性口炎病毒(Vesicular stamotitis virus,VSV)的env基因，编码产生的VSV包膜G蛋白替代了逆转录病毒本身的env糖蛋白，形成VSV-G假型反转录病毒载体，具有更广泛和更高效的转染效率［2］，VSV-G可识别细胞膜上普遍存在的磷脂分子，使构建的假型病毒具有非细胞周期依赖的整合特性，与传统逆转录病毒载体相比，可高效地转染许多静止细胞，同时也降低了逆转录病毒与包装细胞辅助病毒基因的同源性，基本排除了产生可复制的野生病毒的可能。
为了实现特异性基因治疗的目的，提高载体介导基因转移的靶向性，大量研究从基因导入水平、表达水平及产物作用水平进行了尝试，如利用抗体与抗原、配体和受体的特异结合能力，使载体与特异的靶细胞结合，将能与某种类型细胞上特有的受体或抗原结合的配体或抗体插入天然的env受体结合区形成嵌合蛋白并赋予特异性，分两步完成病毒与靶细胞的结合和融合。另外，将组织细胞特异性的启动子与无启动子的外源性基因编码序列组合成嵌合基因，可实现该基因的特异性表达，如肝癌细胞特异性甲胎蛋白AFP启动子。向启动子中插入增强转录活性的元件，用决定组织特异性的增强子序列与转录活性高的病毒启动子构成组装型启动子，使特异性启动子同时控制效应基因和转录激活因子基因的表达，后者的表达产物可与该启动子结合，形成促进特异性表达的正反馈环，使启动子的转录活性达到甚至高出非特异性的病毒启动子［1,3］。
利用逆转录病毒只能感染分裂期细胞的特点，十分有利于脑部肿瘤的基因治疗。一方面成熟的神经细胞不再分裂增殖，而肿瘤细胞处于高增殖状态；另一方面由于血脑屏障的存在，使得向肿瘤部位注射的外源性病毒生产细胞（VPC）可长期存活。理想的基因转染方法是在肿瘤局部环境中连续不断的提供载体质粒来转染周围的肿瘤细胞，基于这一构想，有学者在基因治疗肿瘤的实验中建立了将肿瘤细胞与VPC混合培养的模型，适当延长混合培养时间， VPC持续释放含治疗基因的假型病毒颗粒，使更多不同周期的肿瘤细胞被转染［4］。
2 重组逆转录病毒载体系统仍存在的问题
经过重组及改建的逆转录病毒载体在靶向性和有效性问题上似乎已满足了人类疾病基因治疗的需要，然而，制约这一系统广泛应用于临床的一个重要因素就是它对人体的安全性有待研究，因为病毒感染靶细胞，携带目的基因与宿主细胞染色体随机整合，也就有潜在的引起插入突变、激活原癌基因表达、破坏抑癌基因的危险［5～6］。Angioletti［7］等意识到这一缺陷对基因治疗的不利影响，以葡萄糖6磷酸脱氢酶作为报告基因，利用重组逆转录病毒载体转染鼠骨髓细胞及NIH3T3成纤维细胞，经过大量研究分析，转移基因的突变在真核细胞发生的概率极低，但如果因此忽略这种病毒载体应用的危险性，片面夸大它的有效性则有悖于基因治疗造福人类的最终目标。就目前来看，人们着重于提高它的表达效果，很少有实验精确地研究它所引起的基因突变，而一个点突变可能会引发一种新的功能，或一种潜在有害的免疫蛋白。另外，基因表达沉默现象也是制约基因治疗发展进程的一个重要因素［8］。因此，在基因转移试验用于人类疾病治疗时，慎重的监测和分析转移基因的安全表达及效果十分必要。
3 重组逆转录病毒载体携带目的基因用于基因治疗的研究及思考
重组逆转录病毒载体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）即自杀基因的治疗系统在肿瘤的基因治疗中已进行了大量实验，体外转染肿瘤细胞有基因表达持久而稳定的特点，可引起明显的杀伤效果，国外报道对脑胶质瘤的治疗已进入临床试验阶段，而且在卵巢癌腹膜种植的动物实验中也取得了很好的效果［9］，国内也有通过动物膀胱癌模型，利用该基因转移系统结合抗病毒药物进行治疗，观察到抑制肿瘤生长的报道［10］。另外， D-氨基酸氧化酶能分解D-氨基酸产生具有杀伤作用的H2O2，因此也有实验室用D-氨基酸氧化酶作为安全性自杀基因来感染白血病细胞株，并取得了初步成果，它的非特异性杀伤作用可能有着更广泛的应用范围［11］。刘颖斌［12］等利用重组逆转录病毒载体将血管生成素样4基因转染肝癌细胞株，并通过裸鼠实验观察到该基因的肿瘤抑制效应。目前国内大量研究仍着重于该载体系统的构建和目的基因的稳定表达，如谢宇锋［13］等利用人IL-17F作为目的基因成功构建重组逆转录病毒载体，经过反复多次感染得到较高的病毒滴度，这种血管生成抑制因子也有望在肿瘤治疗方面发挥重要作用；段小军［14］等以缺氧诱导因子HIF-1α基因构建的重组逆转录病毒载体，可高效感染成纤维细胞，该基因的促血管生成作用主要针对心肌梗塞病人的治疗研究。其他疾病如生长激素缺乏症，眼底病变及神经系统紊乱性疾病的基因治疗，也有望通过逆转录病毒载体的重组及改造实现大的突破，逐步满足人类对健康的需求。
由此可见，重组逆转录病毒载体介导的基因转移基本上还处于基础实验阶段，动物实验也只是初见成效，国内报道尚未真正用于人类疾病的基因治疗。基因转移的众多载体中以逆转录病毒载体应用最为广泛，重组的病毒载体从安全性和有效性方面都了很大的改善［15～16］ ，这无疑是实现安全高效基因转移的一次新的飞跃，能否真正做到临床广泛应用，基础研究的突破势在必行。然而，从基础理论到动物实验再到临床应用，也就是说，从基因疗法让人类看到曙光到真正造福于人类，是一个曲折而艰难的过程。相信这一载体介导的基因转移系统经过不断完善能够在肿瘤及遗传性疾病的基因治疗中发挥不可估量的作用。
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作者单位：滨州市人民医院，山东 滨州 256000.