梅毒螺旋体重组蛋白的临床检测应用

【摘要】  　　概括叙述了梅毒流行现状和梅毒螺旋体重组蛋白临床检测应用,对目前常用的抗原和检测方法的优劣作了比较,并指出了主要应用于临床检测的重组抗原的特点和发展趋势。

【关键词】  梅毒;重组蛋白

　　Detection and clinical application of recombinant protein of Trepnoma pallidum.

　　LIU Ling-hui

　　Wanfu Biological Technology Co. Ltd, Guangzhou 510641, Guangdong, P.R. China
   
　　Abstract：  To summary of prevalence of syphilis and the clinic application of recombinant protein of Treponema pallidum to test syphilis, and compare the advantage and disadvantage of the commonly used recombinant antigcn and test methods, and point out the trend of the application of recombinant antigens.

    Key words：Syphilis; Recombinant protein

　　梅毒（Syphilis）是主要的性传播疾病之一，由梅毒密螺旋体苍白天亚种（Treponema pallidum subsp. pallidum，简称TP）引起，能导致心血管及中枢神经系统损害，导致动脉瘤、脊髓痨及全身麻痹、流产、死胎等严重后果。在世界范围内梅毒传染仍是一个重要的公众健康问题。
         
　　据世卫组织1999年报道，全球每年报道的梅毒感染病例数超过120万例，并有5万例以上孕妇感染，其中90%以上在发展中国家。发达国家的梅毒发病率正在下降，但特定人群中仍有较高的发病率，如美国东南地区的少数民族/ ethnic人群，美－非后裔社区怀孕少女TP感染率为1.2%（STD感染率为23.6％）［1］。
         
　　高省、Charles Lin采用文献复习的方法对中国大陆梅毒流行状况进行了研究，结论为自1960年基本消灭梅毒后，当前出现了最为严重的流行情况。且在经济相对发达的沿海地区梅毒患病率较高。估计中国目前有数百万梅毒患者，其中有>40万吸毒患者；>70万FSW（性乱人群）；135万妇女；>200万男男性性接触者（MSM）。而这与中国疾病控制中心统计的趋势一致，都说明中国的梅毒发病率正在上升。
         
　　目前常用的梅毒检测方法是抗原特异性检测，但由于梅毒螺旋体体外培养困难（在兔睾丸中，9～12d平均增长49倍，1981年Fieldsteel等），不能大量获得，所以目前倾向于用重组抗原代替灭活的梅毒螺旋体。

　　1  国外重组蛋白的临床检测应用
         
　　目前有较大规模临床检测报道的基本是rTpN47, rTmpA, rTpN37, rTpN17和rTpN15五种重组蛋白。商业化的试剂盒所用的也主要是这几种。这些报道或者为验证检测方法，或者验证为检测抗原的灵敏度和特异性。

　　1.1 评价EIA检测方法

　　Rodriguez I 等以TP红细胞凝集检测（TP hemagglutination，TPHA）为参照，用重组抗原酶联免疫（EIA, BioSCREEN）方法检测了367例病例，其中梅毒初期38例, 二期10例, 潜伏期早期28例， 胎传梅毒2例, 钩端螺旋体病8例, 传染性单核细胞增多症7例, 肝炎9例, 糖尿病11例, 类风湿性关节炎13例, 麻风11例, 结核9例，HIV/Aids 12例, 系统性红斑狼疮4例, 风湿热3例，老人9例, 孕妇29例和献血者164例。检出的一致率在95.1%。EIA 灵敏度 93.3%，特异性95.5%。而15份梅毒阴性血清用VDRL/RPR检测得到假阳性结果。故此EIA 是一种好的检测梅毒方法［2］。
         
　　Young H等评价了TP酶免微孔检测（EIA）方法。用重组TP抗原的酶免微孔检测了1 055份血清，以Syphilis ICE EIA作为评价标准。酶免微孔检测一次检测和再次检测的特异性分别为99.6%和99.7％，灵敏度100%。Syphilis ICE EIA一次检测和再次检测的特异性分别为（99.8，99.9％）相似，灵敏度99.4％［3］。

　　1.2 评价重组抗原TpN47, TpN17 和TpN15  V. Sambri1, A（2001）评价了用重组抗原TpN47, TpN17 和TpN15的酶联免疫(recomWell Treponema kit) 梅毒检测方法。共检测了782份样本，其中献血者200例;常规梅毒检测人群（高危人群）400例; 梅毒患者122例; 可能有潜在交叉反应者60例。重组抗原TpN47, TpN17 和TpN15酶联免疫（recomWell Treponema kit） ,标准TP全细胞裂解液抗原ELISA（Syphilis Screening kit），微量红细胞凝集 (MHA-TP)三种方法平行检测。结果：recomWell Treponema试剂盒的特异度98.9%，灵敏度98.3%；Syphilis Screenin试剂盒的特异度98.7%，灵敏度98.3%；两者一致率： 100%， 97.8%, 95.9%和95%。recomWell Treponema与MHA-TP. 一致率为 96.7%～98.3%。recomWell Treponema检测TPIgM，无假阳性。早期梅毒患者检出率 17/19［4］。这说明联用重组抗原TpN47, TpN17 和TpN15酶联免疫是一种好的替代达到好的临床检测效果。
         
　　Schmidt BL等评价了9种不同的TP ELISA检测方法，这9种方法是Trepanostika(Organon)、ICE Syphilis(Murex)、Enzygnost　Syphilis(Behring)、Pathozyme Syphilis　Competition(Omega)、Bioelisa Syphilis(Biokit)、Trep-Chek(Phoenix)、TmpA-ELISA(Eurodiagnostica)、Captia Syphilis G(Trinity)、Captia Syphilis M(Mercia)、19S IgM　FTA-ABS，以重组TP抗原或声裂法碎裂TP而得到的抗原进行ELISA。其中Trepanostika (Organon)、Enzygnost　Syphilis(Behring)、Pathozyme Syphilis　Competition (Omega)、Captia Syphilis G (Trinity)、Captia Syphilis M (Mercia) 以TP裂解液为检测抗原，19S IgM　FTA-ABS以TP整菌为检测抗原， ICE Syphilis(Murex) 以重组TpN15、TpN17、TpN47为检测抗原，Bioelisa Syphilis(Biokit) 以重组TpN15、TpN17为检测抗原，Trep-Chek(Phoenix)以混合重组抗原为检测抗原、TmpA-ELISA(Eurodiagnostica)以重组TmpA为检测抗原。52份初期梅毒血清，用MHA-TP检测都为阴性。除Captia Syphilis G 检测方法外，其它8种检测方法的灵敏度(48.5%～76.9%)比VDRL方法（44.2%）更高。高灵敏度的原因可能是：①血清的稀释体积，②设计方法（竞争和捕获法比夹心式灵敏度高），③检测特定蛋白IgG抗体的能力。此外以MHA-TP为参照，用ICE Syphilis 和 Enzygnost Syphilis方法共对2 053份血清进行了平行检测。ICE Syphilis 和 Enzygnost Syphilis检测的特异性分别为99.5%和99.8％［5］。
         
　　Young H评价了一种新的免疫捕获方法（ICE Syphilis; Murex Diagnostics），该方法使用三种抗原联合：TpN15, TpN17和TpN47。将该方法与天然TP抗原EIA方法(Captia Select Syph-G; Centocor)比较。检测了1 184份未知血清。灵敏度用101份阳性血清梯度标本(治疗或未经治疗）测定。ICE Syphilis EIA特异性99.8%，显著高于SelectSyph-G EIA 特异性99.2%(P< 0.02)。ICE Syphilis EIA初次检测灵敏度99%，显著高于SelectSyph-G EIA 灵敏度91.4%(P< 0.01)。ICE Syphilis EIA再次检测灵敏度100%，显著高于SelectSyph-G EIA 灵敏度92.4% (P<0.01)。SelectSyph-G EIA灵敏度显著高于荧光TP抗原－抗体检测（92.4%），但不如TP红细胞凝集检测（97.1%）。ICE Syphilis EIA检测比SelectSyph-G EIA检测的抗体吸收光度值antibody index (absorbance of test serum/kit cutoff)更高。15个HIV患者梅毒检测为阳性，但用SelectSyph-G EIA检测有3个检测是阴性。EIA是对梅毒患者进行筛选的一种理想方法［6］。
         
　　Zrein M等对1 822份血清进行检测。TP EIA（重组TpN15、TpN47）、TPHA和非梅毒性性病检测（Venereal Disease Reference Laboratory，VDRL）。用EIA和VDRL检测了心磷脂和TP抗体。这些样本中，有440份作了进一步TPHA检测。有4份样本VDRL和TPHA检测为阴性，EIA检测为阳性。4个EIA阳性标本，用测序验证100%阳性，而用免疫荧光Western杂交梅毒试剂盒为25％阳性。EIA灵敏度100％，参考50份质控血样，特异性99.8%，检测的是IgG抗体［7］。
 
　　1.3 评价重组抗原TmpA  Stienstra S等进行了基于重组TmpA  ELISA检测。与TPHA和FTA-ABS方法相比较，TmpA  ELISA检测无假阳性结果，对已治愈的梅毒，如只留下血清疤症状者，无阳性反应。所有梅毒阴性者在该次筛查中检测为阴性［8］。
         
　　Ijsselmuiden OE等进行了用两种酶免检测方法——线免疫检测（LIA）和酶联免疫渗滤检测（Enzyme-linked line immunofiltration assay (ELLIFA)）检测了65份未治疗梅毒患者、95份已治疗梅毒患者和60份献血者血清标本。检测的是重组TmpA蛋白和来自Reiter株的纯化轴丝蛋白抗体。与TPHA相比，LIA和ELLIFA。在LIA检测中，两种抗原的血清抗体能在2h内检测到。在ELLIFA检测中，两种抗原的血清抗体能在15min内检测到。ELLIFA方法对短时间检测多种抗原有利［9］。
         
　　O E Ijsselmuiden等用重组TmpA－ELISA检测梅毒。灵敏度为：对早期梅毒76%， 二期梅毒100％，潜伏期早期98％。对938份血清检测特异性为99.6％。与THPA相比，对未经治疗的早期梅毒检测更有用。TmpA血清抗体浓度在1年内显著下降。TmpA可监控梅毒治疗［10］。

　　1.4  评价rTpN47, rTmpA, rTpN17 and rTpN15等联用  Vittorio Sambri等对五种TP重组子（抗原）（rTpN47, rTmpA, rTpN37, rTpN17 and rTpN15) 在膜条上进行杂交检测。检测了450份血清（200份献血者，200份梅毒患者，50份高危人群血样，比较了三种检测方法：重组子Western杂交(recWB)、基于全细胞裂解抗原杂交（in-house whole-cell lysate antigen-based immunoblotting (wclWB)）和TP红细胞凝集检测（T. pallidum hemagglutination (MHA-TP)）。三种方法（recWB, wclWB or MHA-TP.）在高危人群中都没有检出阳性。血清IgG抗体recWB检测梅毒不同病程期的患者发现： rTmpA 是最常检出的抗原 (95%), 仅有41%标本与rTpN37有反应。余者如下： rTpN47, 92.5%; rTpN17, 89.5%; and rTpN15, 67.5%。检出的一致率： recWB 和 MHA-TP ： 95.0% (潜伏期和晚期梅毒为100%)；wclWB和 MHA-TP：92.0%；recWB 和wclWB ：97.5% (二期和晚期：100% ，初期94.6%，潜伏期98.6%)。以MHA-TP 做为参照，recWB灵敏度98.8%（最高），特异性97.1％，wclWB 的灵敏度着97.1%, ，特异性96.1%。故5种抗原联合重组子可作为wclWB检测替代方法。 recWB是检测梅毒抗体的一种好方法［11］。
         
　　Antonella Marangoni 等（2005）用RPR、CLIA、TPHA、WB、EIA 5种方法平行检测了2 590份血清样本，其中献血者2 494例，莱姆病30例，化脓性链球菌10例，单核细胞增多症10例，孕妇5例，抗核因子阳性16例，类风湿因子阳性10例，T. denticola阳性15例。WB方法为TpN47, TmpA, TpN17和TpN15至少3个检出。EIA (Radim, Pomezia, Italy)为检测TpN17 和TpN15重组子。TPHA (AlfaWasserman,Milan, Italy)。RPR (Radim, Pomezia, Italy)。LIAISON Treponema Screen (DiaSorin, Saluggia, Italy) 是一种合格的全自动检测TP抗体特异性方法，用一步法夹心式CLIA（ one-step sandwich CLIA ），含特异性抗原TpN17。除EIA、WB、CLIA外，其它都有交叉反应。五种方法对131份梅毒阳性血清进行平行检测， LIAISON 灵敏度99.2%，特异性99.9%；EIA (Radim, Pomezia, Italy)灵敏度95.4%，特异性99.9%；TPHA灵敏度94.7%，特异性99.9%；RPR (Radim, Pomezia, Italy)灵敏度100%，特异性99.9%；WB方法灵敏度96.3%，特异性97.1%［12］。
         
　　Rostopira N 用重组抗原Enzyme immunoassay (EIA)方法检测TP特异性抗体。抗原为4种不同程度的TP抗原(Tp15, Tp17, TmpA, Tp47)。17- and 47-kDa 蛋白是免疫表位（结构域）。使用第三代EIA试剂盒（Dia-Syph）。其灵敏度为99.4% （165 患者血清）。参照商业化质控品PSS01 (BBI, USA)，无假阳性和假阴性［13］。

　　2 国内应用于临床的重组蛋白检测
         
　　国内众学者先后对不同的重组蛋白进行了临床检测。
        
　　徐雅萍［14］等对临床76份可疑标本用快速血浆反应素试验(RPR )、梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验(TPPA )、梅毒螺旋体特异性抗体乳胶凝集试验(TPLA )、梅毒螺旋体特异性抗体酶联免疫 (TP-ELISA ) 4 种方法检测，TPLA（联合重组抗原TpN47、TpN17、TpN15） 与其他方法的检测结果符合率最高, 灵敏度高。
         
　　张瑞芬［15］等用联合重组抗原( Tp47 、Tp42 和Tp17) 酶联免疫试验(Enzyme immunoassay ,EIA)检测11 份梅毒血凝试验Tp 抗体阳性和28 份阴性血清,灵敏度和特异度分别为100%(11/11)和100%(28/28) 。
         
　　李新鸣［16］等用重组抗原TpN15和TpN47对289份临床标本进行Elisa检测，并与常规方法进行比较。重组抗原（TpN15和TpN47）-ELISA检测与临床符合率达100％。
         
　　赵红胜［17］用TP 快速试纸条(使用TpN47、TpN17、TpN15联合抗原)、TPHA 和TURST方法检测了1 298例临床标本，其中一期梅毒24例，二期梅毒91例，无偿献血者950 例，系统性红斑狼疮85 例，类风湿关节炎36例，乙型肝炎112例。检测结果与TPHA检测方法相符，无假阳性和假阴性结果。
         
　　汤全贵［18］等应用免疫印迹法（重组抗原TpN15、TmpA）和梅毒血球凝集法（TPHA）检测了60例STD患者血清标本，结果两种试验符合率为98.33％，以TPHA方法为参照，免疫印迹法敏感度100％，相对特异性97.22％。

　　3 小结

    从以上结果来看：RPR/VDRL生物学假阳率都高。而基于重组抗原的EIA、WB、ELLIFA和LIAISON的灵敏度和特异性都很高，可用于临床检测。WB比EIA在灵敏度和特异性上要更胜一筹。LIAISON 又胜过WB。ELLIFA方法对短时间检测多种抗原有利。在检测抗原上，目前应用于商品化生产临床检测的梅毒抗原主要是TpN15、TpN47、TpN17、TmpA。根据Poltavchenko AG 和Fujimura等早期对梅毒重组抗原的免疫反应性工作的结果，目前血清学检测应用研究趋向于将2种或2种以上的重组抗原联合使用综合2种或多种抗原的不同特性,从而使其具有更高的特异性和敏感性。
　　rTpN47, rTpN17和 rTpN15联用的效果和TP裂解液的效果高度一致，因此可以用于代替天然TP菌。而TmpA血清抗体浓度在1年内显著下降。可用于监控梅毒治疗，这也是天然TP菌所不具备的。

【参考文献】
  　　［1］Ralph J. Diclemente, Gina M Wingood, Richard A Crosby, et al. A descriptive analysis of STD prevalence among urban pregnant African-American teens: Data from a pilot study［J］. Journal of Adolescent Health, 2004,34:376～383.

　　［2］Rodriguez I, Alvarez EL, Fernandez C, et al. Comparison of a recombinant-antigen enzyme immunoassay with Treponema pallidum hemagglutination test for serological confirmation of Syphilis［J］. Mem Inst Oswaldo Cruz, 2002,Apr;97(3):347～349.

　　［3］Sambri V, Marangoni A, Simone MA, et al. Evaluation of reconWell Treponema, a novel recombinant antigen-based enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of syphilis［J］. Clin Microbiol Infect,2001,7(4):200～205.

　　［4］Young H, Aktas G, Moyes A. Related Enzywell recombinant enzyme immunoassay for the serological diagnosis of syphilis［J］. Int J STD AIDS,2000,11(5):288～291.

　　［5］Schmidt BL, Edjlalipour M, Luger A. Comparative Evaluation Of Nine Different Enzyme-Linked Immunosorbent Assays For Determination Of Antibodies Against Treponema Pallidum In Patients With Primary Syphilis［J］. J Clin Microbiol. 2000 Mar;38(3):1279～1282.

　　［6］Young H, Moyes A, Seagar L, et al. Novel Recombinant-Antigen Enzyme Immunoassy For Serological Diagnosis Of Syphilis［J］. J Clin Microbiol. 1998 Apr;36(4):913～791.

　　［7］Zrein M, Maure I, Boursier F, et al. Recombinant Antigen-Based Enzyme Immunoassay For Screening Of Treponema Pallidum Antibodies In Blood Bank Routine［J］. J Clin Microbiol,1995 Mar;33(3):525～527.

　　［8］Stienstra S, Peeters T, Van Der Straaten AM, et al. Treponema Pallidum Membrane Protein A ELISA: A New Test For Screening And Diagnosis Of Syphilis［J］. Beitr Infusionsther. 1992;30:85～91.

　　［9］Ijsselmuiden OE, Beelaert G, Schouls LM, et al. Line Immunoassay And Enzyme-Linked Line Immunofiltration Assay For Simultaneous Detection Of Antibody To Two Treponemal Antigens［J］. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1989 Aug;8(8):716～721.

　　［10］O E Ijsselmuiden, L M Schouls, E Stolz, et al. Sensitivity And Specificity Of An Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Using The Recombinant DNA-Derived Treponema Pallidum Protein Tmpa For Serodiagnosis Of Syphilis And The Potential Use Of Tmpa For Assessing The Effect Of Antibiotic Therapy［J］. J Clin Microbiol，1989 January; 27(1): 152～157.

　　［11］Snbri V, Maragoni A, Eyer C, et al.Western immunoblotting with five Treponema pallidum recombinant antigens for serologic diagnosis of syphilis［J］. Clin Diagn Lab Immunol,2001,8(3): 534～539.

　　［12］Antonella Marangoni, Vittorio Sambri, Silvia Accardo， et al.Evaluation of LIAISON Treponema Screen, A Novel Recombinant Antigen-Based Chemiluminescence Immunoassay For Laboratory Diagnosis Of Syphilis［J］. Clinical and diagnostic laboratory immunology, 2005,12(10):1231～1234.

　　［13］Rostopira N, Tkacikova L, Rayevska G, et al. Elaboration of enzyme immunoassay based on recombinant antigens and intended for diagnostics of syphilis［J］. Folia Microbiol (Praha),2003,48(4):549～553.

　　［14］徐雅萍, 肖征, 沈定霞,等.4种不同方法检测梅毒螺旋体抗体的比较［J］.中华医院感染学杂志,2003,13(1)：87～88.

　　［15］张瑞芬,庄辉,蒋志彬,等.不同梅毒螺旋体基因重组抗原酶联免疫试验比较［J］. 中国公共卫生,2002,18 (6):673～674.

　　［16］李新鸣，李鲁平，陈之新,等. 基因重组抗原检测梅毒螺旋体［J］. 微生物学杂志,2000,20(1):1～2.

　　［17］赵红胜. 梅毒螺旋体抗体快速检测试纸条的应用［J］. 中国误诊学杂志,2003,4:81～82.

　　［18］汤全贵，顾伟鸣，张皓,等.免疫印迹法与血球凝集法实验诊断梅毒的比较研究［J］.临床皮肤科杂志,1995,6:348.

作者单位：万孚生物技术有限公司,广东 广州 510641.