点击显示 收起
【摘要】 目的 建立一种新型、快速的检测病原菌方法。方法 以金属鳌合免疫化微球、醛基免疫磁性微球和氨基免疫化磁性微球为载体，利用金黄色葡萄球菌表面A蛋白、G群链球菌表面G蛋白与IgG分子特异性结合的原理，富集检测病原菌。结果 制备的三种免疫磁性微球每克均可在2h内至少固定60mg人IgG，经SDS-PAGE和wester Blot分析，也均能在1h内鉴定出分离得到的金黄色葡萄球菌和G群链球菌，且以醛基化免疫磁性微球检测效果最好。结论 以免疫微球检测金黄色葡萄球菌和链球菌操作稳定性，成本低，有望在临床检验以及微生物检测等方面得到广泛应用。
【关键词】 免疫磁性微球; 病原菌; 检测
Preparting a specific inert immuno-magnetic beads for rapid detection and sepration of pathogenic bacteria.
LIU Lin-lin.
(Department of Pathology of Shandong Higher Learning Institute, Linyi 276002, Shandong, P. R.China)
Abstract：Objective To establish a low cost and high sensitive method for rapid detection and separation of pathogenic bacteria. Methods The Fc regions of immobilized antibodies were fully accessible to adsorb protein A or protein G. Three different kinds of immuno-magnetic beads (IMB) were prepared for rapid detection and separation of pathogenic bacteria. Results Aldehyde magnetic beads was the best magnetic beads in use. Conclusion This system established can be widely used in bioanalytical chemistry for rapid detection and separation of targeted pathogenic bacteria in one step.
Key words：Immuno-magnetic beads; Pathogenic bacterium; Detection
金黄色葡萄球菌（S. aureus ）和G群链球菌（Group G Streptococcus）是极具代表性的医源性感染及群发性感染病原菌。传统检测病原微生物方法步骤多，所需时间长，速度慢，难以适应食品检测、现代临床快速诊断与治疗需要，在菌浓度较低的情况下易造成漏检［1］。多数免疫学技术，如荧光标记抗体试验、酶联免疫试验（ELISA)、放射性免疫试验得到广泛应用［2］，但所需成本高，耗时且需对样品进行复杂预处理。快速检测结果对及时使用抗生素、多肽、干扰素等正确抑制手段来控制相关病原菌的爆发和扩散有重要意义。因此，建立病原菌快速分离检验体系有重要现实意义和应用价值。
金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA) 是致病性金黄色葡萄球菌表面一种特有蛋白质,可与免疫球蛋白G（IgG）的Fc片段特异性结合［3］, G群链球菌的细胞壁上存在一种G蛋白，能与人IgG的四个区域结合，可用来建立一种致病性金黄色葡萄球菌、G群链球菌快速分离检验体系。本研究将人IgG分子固定到三种不同的磁性微球表面，用于金黄色葡萄球菌和G群链球菌的快速检测以及分离。通过对比研究，找到最佳免疫化磁性微球。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂
人IgG（鼎国）；小牛血清（BSA，TBD）；碱性磷酸酯酶标记的羊抗鼠IgG（AP-goat antimouse IgG）、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐/丁基苯酞（BCIP/NBP）、N-(β- 氨乙基)- 氨丙基三乙氧基硅烷(AEAPS)，购自Sigma。Fe3O4磁流体、表面带氨基磁性微球、表面带醛基磁性微球、金属螯合磁性微球（自制［4～7］）；乙醛-右旋糖苷（按Fuentes和Fernandez-Lafuente所报道方法制备［8］）；正已醇，环已烷，无水乙醇等其它试剂均为市售分析纯。
1.2 免疫化磁性微球的制备
1.2.1 磁性微球的免疫化
按Fuentes等方法将人IgG分子用高碘酸钠氧化后保存在磷酸盐（PBS pH7.5,0.15mol/L-1）缓冲液中［8］。人IgG分子分别加入0.5ml（ 0.5mg/ml-1）三种带有不同基团的磁性微球中，4℃下轻摇过夜。PBS（0.01M pH7.4，含0.1%BSA）洗3次，过量ddH2O充分洗涤微球备用。（免疫化过程见图1）
1.2.2 乙醛-右旋糖苷的包被
醛基免疫磁性微球重悬于pH7.6，100mM/L-1PBS中，加入乙醛—右旋糖苷,室温振荡培养12h。加入固态硼氢化钠至pH10。持续反应2h,PBS洗涤。过量ddH2O洗涤除去被磁性微球吸收的右旋糖苷。
1.3 免疫磁性微球承载人IgG分子能力
不同量（1、2、5、50、75和100mg）人IgG分别与2ml，0.5g/ml-1三种免疫磁性微球在PBS(0.15mol/L-1 pH7.5)中，4℃孵育过夜。ddH2O充分洗涤，Bradford方法［8］检测免疫磁性微球固定蛋白量。
1.4 不同磁性微球固定化人IgG分子速率
10mg人IgG分子分别加入2ml，0.5g/ml-1三种不同磁性微球，每隔30min用Bradford方法［8］检测上清液中蛋白浓度。
1.5 亲和捕捉病原菌实验
将金黄色葡萄球菌（0.95ml，约2.0×103CFU）、G族链球菌（0.95ml约2.0×103CFU）与大肠杆菌（0.95ml，约2.2×103CFU ）的混合物分别加入0.1ml三种免疫磁性微球，室温孵育10min，20min，1h，2h。磁场分离,取混合物上清涂平板，37℃，过夜培养记录菌落形成单位（CFU）。
1.6 亲和捕捉病原菌的免疫印记（Western blot）分析
1ml，0.5g/ml-1的三种免疫化磁性微球分别加入9ml金黄色葡萄球菌和9ml的G群链球菌中，37℃孵育1h。加入适量溶菌酶37℃孵育30min，磁场分离,样品煮沸15min，取上清20μl进行蛋白电泳分离［8］。电泳后两快凝胶，一块进行染色及脱色处理，另一块凝胶上的蛋白采用免疫印记（western blot）检测蛋白。
2 结果
2.1 不同磁性微球承载人IgG分子能力
图2看出醛基磁性微球具有最高，装载IgG分子能力是IDA-Cu磁性微球的三倍。三种磁性微球每克至少能装载60mg人IgG分子。为确保IgG分子全部固定在磁性微球表面及乙醛-右旋糖苷的包被，以下实验中每种磁性微球表面只固定10mg人IgG分子。
2.2 不同磁性微球固定化人IgG分子的速率
图3看出三种磁性微球固定化IgG的速率不同。氨基磁性微球和醛基磁性微球的固定化速率相差不大，金属螯合磁性微球固定化速率前0.5h要明显快，后又大幅度下降。这是因为金属螯合磁性微球与人IgG分子的固定是通过IgG分子Fc端富含His区域与微球表面金属螯和反应来实现的［9］。人IgG分子的Fab端与微球表面的空间位阻效应降低了固定化人IgG分子的速率也使其人IgG分子承载能力下降。
2.3 不同微球表面固定人IgG分子的SDS-PAGE检测
上清样品进行SDS-PAGE分析表明，虽然磁性微球装载IgG分子的能力不同，但在给予每种磁性微球10mg人IgG分子的情况下，所有的IgG分子都被有效地固定在相应磁性微球表面。图4中蛋白条带显示出每种磁性微球的表面固定人IgG分子量几乎相同。
2.4 不同免疫磁性微球亲和捕捉病原菌效果实验分析
三种磁性微球都不能捕获任何细菌（图5 a，c），而三种免疫化磁性微球均能在较短的时间内（30min）从病原菌与大肠杆菌（E. coli）的混合溶液中有效地捕捉并分离出病原菌，其中效率最好是醛基免疫化磁性微球（图5b，d）。结果表明，固定在不同磁性微球表面的人IgG分子能够有效地识别并结合位于金黄色葡萄球菌及G群链球菌细胞表面的SPA和SPG。
2.5 亲和捕捉病原菌的免疫印记实验（Western Blot）
免疫印记实验（Western Blot）结果表明：三种免疫磁性微球都能够成功地捕捉到金黄色葡萄球菌和G群链球菌。
图6 A中具有IgG亲和结合能力的蛋白条带（SPG）分子量为37kDa，比报导的分子量稍大。这是因为在SPG的结构中W区域存在有大量脯氨酸，使蛋白电泳迁移速率下降。
图6中A图条带信号明显比B图条带信号模糊。这是因为，SPA和SPG都具有多个与IgG分子进行亲和结合的位点，一个蛋白分子可以结合多个IgG分子［10］，使得PAGE胶的条带信号在经过免疫印记实验后放大。
Group 1，3和5表示混合溶液上清中大肠杆菌的菌落形成单位数（CFU）；Group 2，4和6表示混合溶液上清中病原菌的菌落形成单位数（CFU）。Group 1-6用于病原菌捕捉实验分别是金属螯合磁性微球、金属螯合免疫化磁性微球、氨基磁性微球、氨基免疫化磁性微球、醛基磁性微球和醛基免疫化磁性微球。（a）和（b）中所用病原菌是金黄色葡萄球菌；（c）和（d）中所用病原菌是G群链球菌。
3 讨论
与其它传统鉴定和分离金黄色葡萄球菌（S. aureus）以及G群链球菌(Group G Streptococcus)的方法相比，本研究所采取的捕捉和分离病原菌方法要明显的简便和快速得多。结果显示，采用本研究所的方法体系能够通过样品孵育以及随后的磁场分离两个步骤在1h内鉴定出并分离得到金黄色葡萄球菌以及G群链球菌。
如果在磁珠表面接上不同的抗体，能分离其它的细胞和蛋白。此方法有望在临床检验以及微生物检测等方面得到大力应用。
【参考文献】
［1］Byung-Keun Oh,Yong-Kee Kim. Surface plasmon resonance immunosensor for the detection of Salmonella typhimurium［J］. Biosensors and Bioelectronics, 2004,19(11):1497～1504.
［2］L.P.Mansfield, S.J.Forsythe. The detection of Samonella using a combined immunomagnetic separation and ELISA end-detection procedure［J］. Lettters in Applied Microbiology, 2000, 31(4):279～283.
［3］Moks T, Abrahmsen L, Nilsson B, et al. Staphylococcal protein A consists of five IgG-binding domains［J］. Eur J Biochem, 1986,156(3):637～643.
［4］Lei H, Deng L. The preparation and catalytically active characterization of papain immobilized on magnetic composite microsperes［J］. Enzyme Microb Technol ,2004, 35(1):15～21.
［5］Cheng F L. Immobilization and Stabilization of Papain on SiO2 Particles Containing Amine Groups［J］. Chinese Journal of Biotechnology,2004,20(2):287～290.
［6］Chen LL, Deng L. Immunomagnetic separation and MS/SPR end-detection combined procedure for rapid detection of Staphylococcus aureus and protein A［J］. Biosens Bioelectron, 2007,22(7):1487～1492.
［7］刘琳琳,邓乐.金属螯合载体定向固定化木瓜蛋白酶的研究［J］.生物工程学报,2005,21(5):781～793.
［8］Bradford MM, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein–dye binding［J］. Anal Biochem,1976 ,7 (72):248～254.
［9］Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］. Nature,1970,277(259):680～685.
［10］Amit.A.G, Mariuzza.R.A, Phillips.S.E.V. Three-dimensional structure of an antigen-antibody complex at 2.8? resolution［J］. Science, 1986, 233(4765):747～753.
作者单位：山东医学高等专科学校病原学教研室,山东 临沂 276002.