变应性接触性皮炎动物模型的研究进展

【摘要】  　　变应性接触性皮炎(ACD)是迟发型变态反应引起的炎症性皮肤病，涉及多种炎症介质和瘙痒介质。ACD的发生机制及其免疫反应机制在国内外已有较多的研究，但有关ACD伴发的瘙痒机制研究甚少，瘙痒介质也不明确。评价ACD的方法有多种，可归纳为炎症评价和瘙痒评价。目前公认的被用于评价实验动物瘙痒程度和作为临床观察瘙痒的客观指标为动物的搔抓行为。

【关键词】  变应性接触性皮炎；动物模型；炎症；瘙痒

　　Advance in the research of allergic contact dermatitis animal model. 

　　CHEN Lei, FAN Yi-ming.

　　Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, Guangdong, P. R.China

    Abstract：Allergic contact dermatitis (ACD) is an inflammatory dermatologic disease induced by delayed type allergy. It refers to many kinds of mediators of inflammation and itch. There are many researches about the mechanism of development and immunological reaction of ACD, but there is very few researches on the mechanism of itch that accompanied by ACD, and the mediators of itch are not clearly. There are many evaluation methods of ACD, which can be inducted as inflammation and itch. To date the generally accepted objective index used to evaluate degree of animal itch and to observe itch is scratching.

    Key words：Allergic contact dermatitis; Animal model; Inflammation; Itch

    变应性接触性皮炎(Allergic contact dermatitis, ACD)是皮肤或粘膜接触致敏物后，由T细胞介导的迟发型变态反应引起的炎症性皮肤病，多形性皮疹、剧烈瘙痒、易于复发是其临床特征。ACD的发病和瘙痒机制尚未明确，目前常用的抗组胺药和抗5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)药无确切疗效。动物模型的建立对于阐明ACD的发病和瘙痒机制、观察药物疗效和开发新型止痒药物具有重要意义。

　　1  ACD模型的建立

　　1.1  实验动物 

　　目前已用于制作ACD模型的动物有啮齿动物（小鼠、大鼠、豚鼠）、猪、狗。因啮齿动物具有对致敏物的敏感程度高、繁殖力强及便于饲养等优点，故在ACD模型中使用较多，特别是小鼠最为常用［1～5］。

　　1.2 半抗原 

　　二硝基氟苯(Dinitrofluorobenzene, DNFB)、二硝基氯苯、三硝基氯苯(Trinitrochlorobenzene, TNCB)、荧光素-5-异硫氰酸盐、三氯乙烯、甲苯二异氰酸酯（Toluene-2,4-diisocyanate, TDI）等为常用的半抗原，其中DNFB应用较多［1～3,5］。

　　1.3 方法 

　　制作ACD动物模型包括致敏期和激发期，即先外用半抗原致敏，数天或数周后再外用同一半抗原激发，靶部位多数选择耳廓或背部皮肤。目前最常用动物模型是在实验第1、2d腹部外涂0.5％DNFB致敏，第6d耳廓或项背部外涂0.2％DNFB激发［1～3,5］。

　　2 ACD的发病机制

　　2.1 免疫学机制 

　　引起ACD的致敏物多属半抗原，需与表皮细胞的载体蛋白结合而形成全抗原，表皮内朗格汉斯细胞摄取、加工抗原后移行至局部淋巴结，再将抗原提呈给T淋巴细胞；致敏的T淋巴细胞转化为淋巴母细胞，再增殖、分化为记忆和效应T淋巴细胞，通过血液循环到达全身各处；这一过程称为致敏期或诱导期，约需4～7d完成。当致敏个体再次接触同一致敏物，一般在24～48h内即可进入激发期或效应期，此时致敏物仍需先形成全抗原，再与已致敏T淋巴细胞结合及相互作用，使效应T淋巴细胞释放多种淋巴因子，激发局部炎症反应［6］。

　　2.2 炎症介质

　　2.2.1 神经肽 

　　P物质（Substance P, SP）、神经激肽A（Neurokinin A, NKA）、降钙素基因相关肽（Calcitonin gene related peptide, CGRP）等神经肽参与速发型和迟发型皮肤超敏反应的调节。SP可通过舒张血管、增加血浆外渗及诱导淋巴细胞浸润而加重ACD［7,8］，SP 激动剂和拮抗剂分别增强和抑制皮肤细胞免疫应答［1］。皮内注射spantide-NK1受体（SP的主要受体）拮抗剂可抑制ACD小鼠的局部炎症反应，这种抑制效应呈剂量依赖性［9］。与正常小鼠相比，NK1受体缺陷小鼠的ACD反应明显减弱，皮肤仅见轻微水肿，白细胞浸润程度降低50%［1］。噁唑酮激发后24h，小鼠皮损区SP阳性神经纤维数比对照组小鼠明显增多［11］。

    Scholzen等［1］在C57BL/6J小鼠的ACD模型中，发现SP和NK受体在维持完整的免疫应答中起着不可或缺的作用；SP和NK1受体增强或促进ACD免疫应答，而NKA和NK2受体作用相反。NKA可诱导产生超氧负离子，增强T细胞增殖和中性粒细胞粘连；NKA也可诱导一氧化氮合酶表达和促进一氧化氮释放，抑制ACD的炎症反应［1］。CGRP的作用与NKA相似，对速发型和迟发型超敏反应均有较强的抑制作用［1］。

　　2.2.2 细胞因子 

　　局部表达的细胞因子在调节组织炎症反应过程中起着至关重要的作用。在接触性致敏过程中，白介素-1（IL-1)在朗格汉斯细胞的活化、迁移和抗原提呈中起重要作用，皮内注射IL-1可诱发ACD样皮肤反应［12,13］。Nagai等［14］在用DNFB建立的转基因小鼠ACD模型中，发现皮肤炎症反应的发生、发展与IL-5 mRNA表达上调及血清IgE水平升高有关。Plitz等［15］发现IL-18通过增加微血管通透性而加重炎症反应；在用DNFB建立的C57BL/6小鼠ACD模型中，应用IL-18结合蛋白可减少靶部位T细胞浸润及干扰素-γ（IFN-γ）的产生，从而抑制炎症反应。在TNCB诱导的ACD模型中，系统性应用IL-4可使Th1型反应转变为Th2型反应，并可长时间保护接触部位皮肤，使其免受炎症性损伤，推测IL-4是终止而不是诱导ACD发生。在TNCB或DNFB诱导的小鼠ACD模型中，IFN-γ mRNA在激发后12h时已经产生，18h达到高峰；IL-4 mRNA在整个过程中未被检测到，但系统性应用IL-4可明显降低IFN-γ的峰值，提示IL-4在ACD的发生、发展中起抑制作用［10,16］。

　　2.2.3 其他 

　　血管紧张素转化酶（Angiotensin-converting enzyme, ACE）通过降解SP及SP诱导产生的缓激肽调节皮肤炎症反应。在啮齿动物ACD模型中，ACE缺陷型小鼠与野生型小鼠相比，前者因SP和缓激肽过度释放，炎症反应如耳部肿胀程度及炎症细胞浸润程度等比后者明显，后者应用ACE拮抗剂可产生类似前者反应，由此可见ACE在ACD的发生、发展中起着重要作用［2］。位于细胞表面的中性肽链内切酶（Neutral endopeptidase, NEP）是降解SP的主要物质，NEP缺陷型ACD小鼠与野生型ACD小鼠相比，前者耳部肿胀程度比后者超出2.5倍，并伴有明显的血浆渗出及炎细胞浸润，此反应可在应用NK1受体拮抗剂后或在激发前3d及激发后局部反复使用辣椒辣素后所抑制，野生型ACD小鼠则在应用NEP拮抗剂后ACD反应增强，提示NEP与皮肤中的神经肽在ACD的发病机制中起着重要作用［3］。

　　3 ACD的瘙痒介质

    利用半抗原建立ACD模型已有数十年历史，但以往的研究多数集中在ACD的发病机制、免疫反应和药效学方面，有关ACD伴发瘙痒机制研究甚少，瘙痒介质也不明确。非镇静型H1、5-HT1/2受体拮抗剂不能减少TDI诱导的ACD小鼠的搔抓次数［4］，5-HT2、5-HT3受体拮抗剂对DNFB诱导的ACD大鼠搔抓行为也无影响［18］，推测组胺和5-HT可能在ACD瘙痒中不起主要作用。
   
　　人类和小鼠皮内注射SP可诱导局部皮肤瘙痒［19］，肥大细胞缺陷型小鼠皮内注射SP也可诱发瘙痒反应［20］。SP诱导的小鼠瘙痒反应可被NK1受体拮抗剂抑制，但不受NK2、NK3受体拮抗剂的影响［20］。SP可能通过两种机制引起瘙痒：一是通过激活传导痒觉的无髓C纤维上的NK1受体而直接引起瘙痒［21］，二是通过促进肥大细胞和角质形成细胞（KC）释放瘙痒介质而间接引起瘙痒［22～25］。SP可通过激活肥大细胞表面的NK1受体或直接与G蛋白结合引起脱粒和组胺释放［22］，也可激活KC表面的NK1受体而促进白三烯B4（LTB4）释放或NO合成，从而引起或增强瘙痒［23～25］。NK1受体拮抗剂能抑制小鼠ACD的发生［9］，推测SP可能是ACD瘙痒的重要介质之一。

    另一可能参与ACD的瘙痒介质为LTB4。SP可诱发皮肤花生四烯酸级联反应，小鼠皮内注射SP后皮肤LTB4和前列腺素E2含量均升高。Andoh等［24］发现，LTB4受体拮抗剂可显著抑制SP诱发的瘙痒反应。皮内注射LTB44 0.03nmol诱发的小鼠搔抓次数与SP 100nmol者相同。NK1受体拮抗剂可抑制SP诱导的皮肤LTB4明显增加和前列腺素E2轻微增加，且SP可使小鼠KC内Ca2+浓度增多。这些结果提示LTB4在SP诱发的小鼠瘙痒中起重要作用，而KC是皮内注射SP后LTB4的主要来源。目前的观点认为，SP与KC上的NK1受体结合，激活花生四烯酸级联反应生成LTB4，再由LTB4致痒［24］。

　　4  ACD模型炎症程度及抗炎药物疗效的评价

　　4.1  耳廓皮损严重程度的评价 

　　以耳廓为靶部位的ACD模型通常按双耳廓红斑、水肿及渗出程度分别分度和计分，并用测厚规分别测量激发前后双耳廓厚度，观察完毕处死动物切取耳廓称重，测定皮肤炎症肿胀程度。皮肤肿胀度（％）＝(炎症皮肤重量－健康皮肤重量)/健康皮肤重量×100％［4,5］。

　　4.2 背部皮损严重程度的评价 

　　以背部为靶部位的ACD模型测定背部皮肤肿胀程度。与以耳廓为靶部位的ACD模型相比，以背部为靶部位的模型具有肿胀程度高、易于用肉眼观察或触摸判断肿胀程度的优点［5］。

　　4.3 组织病理学与免疫病理学检查 

　　活检标本用HE染色、免疫组织化学或免疫荧光方法观察表皮增生、真皮水肿、炎症细胞浸润、神经纤维变性、胶原纤维变性、神经肽及其受体的表达等，计算单位面积中浸润炎症细胞的数量［2,3,5］。

　　4.4 分子生物学方法 

　　除上述方法外，还可用ELISA、RT-PCR技术、蛋白印迹技术、皮肤微量渗析法等对皮损内表达的炎症介质、受体、酶及细胞因子等进行定量或半定量检测［24］。

　　5 ACD模型瘙痒程度的评价

    瘙痒是ACD的主要症状。瘙痒作为一种主观感觉，长期以来无法对其进行客观评价，发生机制尚未完全阐明，目前公认的用于评价实验动物瘙痒程度和作为临床观察瘙痒的客观指标为动物的搔抓行为。1次搔抓是指啮齿动物后爪对涂药部位或注射部位的1次或连续多次搔抓，后爪落地或被舔吃撕咬时代表本次搔抓活动的结束，前肢的活动以及后爪对面、耳、腹部等处的搔抓则不作统计［4］。

    尽管很难确定啮齿动物的搔抓行为是由瘙痒、疼痛或其他感觉所致，但明确搔抓性质是瘙痒模型研究的关键。在TDI诱导的小鼠ACD模型中，作为判断炎症程度的水肿和搔抓反应的时程曲线呈非同步变化，皮下注射阿片受体拮抗剂纳洛酮显著抑制了ACD小鼠的搔抓行为但不减轻水肿程度。鉴于纳洛酮增强而非抑制疼痛反应行为，故可排除ACD小鼠搔抓行为源于痛觉，推测搔抓行为源于痒感而与水肿关系不大［4］。

　　6 小结
    
　　ACD是以皮肤瘙痒为主要症状的炎症性皮肤病，其发生、发展与许多炎症介质和瘙痒介质有关。建立ACD动物模型，评价其瘙痒程度和检测皮损中各种炎症介质或瘙痒介质，对于阐明ACD瘙痒的发生机制、止痒药物的选择和开发新型止痒药物具有重要意义。目前，用DNFB建立的小鼠ACD模型已成为研究迟发型变态反应的经典模型，但有关ACD伴发瘙痒的机制还有待进一步探讨。

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作者单位：广东医学院附属医院皮肤性病科,广东 湛江 524023.