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【摘要】 目的 观察灵芝孢子对2型糖尿病大鼠肾脏组织细胞色素C(Cyt-C)及线粒体钙的影响。方法 将清洁级Wistar大鼠50只，雌雄各半，随机分成3组（正常组、模型组、灵芝孢子组）。模型组及灵芝组以25mg/kg的剂量一次性腹腔注射链尿佐菌素（STZ），正常对照组腹腔注射等量柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。正常饮食喂养2wk后，进行糖耐量试验，模型组和灵芝组以糖耐量异常者保留，并改喂高脂高糖饮食，灵芝组另加灵芝孢子（250mg/kg/d）持续10wK，动物均单独喂养，实验结束前一天做糖耐量试验，取肾脏检测肾脏组织胞色素C、线粒体钙的水平。 结果 模型组肾脏组织线粒体Cyt-C、线粒体钙均显著低于对照组和灵芝孢子粉组(P<0．05)，胞质Cyt-C显著高于对照组和灵芝孢子粉组(P<0．05)。结论 灵芝孢子对糖尿病大鼠肾脏组织具有保护作用。
【关键词】 糖尿病肾病；灵芝孢子；细胞色素C；线粒体钙；大鼠
Effects of Ganodermal lucidum spores on cytochrome C and mitochondrial calcium in the Kidneys of NIDDM Rats.
LIU Ying, WANG Shu-qiu，KANG Yu-ming, et al.
1. College of Basic Medical Sciences,Jiamusi University,Jiamusi, 154007, Heilongjiang, P.R.China;
2.Shanxi Medical University,Taiyuan 030001, Shanxi, P. R. China
Abstract：Objective To observe the effects of Ganoderma lucidum spores on cytochrome C (Cyt-C) and mitochondrial calcium in the kidneys of NIDDM rats. Methods Fifty Wistar rats (half male and half female) were divided randomly into three groups , model group, Ganoderma lucidum group and normal control group, the first two groups were given 2% streptozotocin (25mg/kg) through peritoneal injection and those at control group were given equivalent amount of sodium citrate/citrate buffer solution. Glucose tolerance tests were performed two weeks after normal diet,and the rats with abnormal glucose tolerance were included in the model and Ganoderma lucidum group and those with normal glucose tolerance were excluded. Then the rats in the model and Ganoderma lucidum groups were given high-fat and high-carbohydrare food. In addition, the rats in Ganoderma lucidum group were given Ganoderma lucidum spores (250mg/kg·d) for a duration of 10 weeks, and all rats were fed individually. Glucose tolerance tests were conducted again a day ahead the ending of the observation. Then the kidneys of the rats were taken out and the levels of cytochrome C (Cyt-C) and mitochondrial calcium were determined. Results The NIDDM model was successfully constructed. The levels of mitochondrial Cyt-C and mitochondrial calcium were significantly lower in model group than that of the Ganoderma lucidum group and control group (P<0.05). While the level of plasma Cyt-C in the model group was significantly higher than that of the Ganoderma lucidum group and the control group (P<0.05). Conclusion Ganoderma lucidum spores is capale of protecting the kidneys of NIDDM rats.
Key words：Ganoderma lucidum spore; Diabetic nephropathy; Cytochrome C; Mitochondrial calcium; Rat
全球糖尿病的平均患病率目前大约为5．7％或更多，亦即现今共有超过2．3亿的糖尿病患者，并且正以每年新增700万人的速度递增。预计到2025年，全球糖尿病的患病率将接近成年人群的7％左右［1］。糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的主要的微血管慢性并发症。由于2型糖尿病患者数量多，由其引发的终末期肾病(ESRD)严重影响人们的健康。研究2型糖尿病引发DN的发病机制和对防治控制一直是重大的课题。细胞色素C在线粒体途径的凋亡过程中发挥着关键作用［2］。细胞色素C是呼吸链的一个重要组成部分，传递电子给氧，从而促进氢和氧的结合，Cyt-C缺乏时，电子传递链被阻断，ATP合成减少及活性氧(ROS)过度生成。ROS蓄积和清除不足所致的氧化应激是在糖尿病肾病的发生中起重要作用。灵芝作为一种名贵中药，具有降血糖、降血脂、清除自由基的作用早就被人们所注意。本实验通过观测2型糖尿病大鼠肾脏组织Cyt-C、线粒体钙的水平变化，进一步探讨灵芝孢子对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及DN的发病机制。
1 材料与方法
1．1 动物分组及模型建立
清洁级Wistar大鼠50只，4～6月龄，体重180～220g，佳木斯大学实验动物中心提供，随机分成3组（对照组、模型组、灵芝孢子组）。Wistar大鼠禁食16～18h，自由饮水，模型组及灵芝孢子组每只一次性腹腔注射2％链尿佐菌素（STZ）25mg/kg（北京拜尔迪生物技术有限公司提供)，正常对照组腹腔注射等量柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。正常饮食喂养2wk后，进行糖耐量试验，模型组和灵芝孢子组以糖耐量异常者保留，余去除。模型组改喂高脂高糖饲料，灵芝组每天另加灵芝孢子粉250mg／kg·d持续10wk。动物均单个喂养，室温l8～24℃。每2wk称体重1次，实验结束前1d做糖耐量试验。
1．2 样本采集
实验结束时，动物在乙醚麻醉下，大鼠禁食12h，乙醚吸入浅麻醉，内眦静脉取血。2 000r／min离心15min，取血清贮存于﹣20℃冰箱中，低温保存，待测血清胰岛素。然后断髓处死动物，并且取下腹正中切口，迅速取出肾脏，用冷生理盐水冲洗，除去血液，滤纸拭干，电子天平精确称重，待测各项指标。
1．3 指标的检测
1．3．1 糖尿病大鼠肾脏线粒体、胞浆的提取
取9倍于组织块重量的生理盐水，将其倒入小烧杯内，用眼科剪刀尽快剪碎组织块，倒入玻璃匀浆管中，匀浆约3～4min，制备成10％组织匀浆。然后用低温低速离心机以1 500r／min离心10min，弃沉淀，取上清液以10 000r／min低温离心15min，上清液为胞质，沉淀物为线粒体。取沉淀物加入分离介质（0．1mol／L Tris-HC1、pH7.4，1mmol/L KCL，两者以1：1配制）缓冲液0．5ml制成线粒体悬液。
1．3．2 肾脏组织线粒体及胞质Cyt-C的测定
取线粒体悬液超声波破碎机(RSM-60S，宁波新芝科器研究所)破碎3次，破坏线粒体膜，制成待测样品，胞质直接作为样品，用改良的张均田法［3］测定。即取0．4ml待测样品，用水稀释至10ml，取1ml稀释液，加水3ml，再加少许连二硫酸钠，振摇后，紫外分光光度计在520nm处测量吸光度A值，由标准曲线计算其浓度。
1．3．3 肾脏组织线粒体钙的测定
采用火焰原子吸收法。取线粒体悬液1．5ml置于10ml加盖刻度试管中，加入浓硝酸5ml，阴暗处硝化一周。然后烘箱加热使硝酸尽量分解蒸发，加入，加入1％的氯化镧至10ml，混匀制成待测品。用原子吸收分光光度计 (AA-6601F，岛津)测吸收光密度，由标准曲线计算浓度。
1．4 统计学处理
各项指标的测定结果均以x±s表示，进行t检验，组间比较用方差分析(LSD检验)。用SPSS 11．5软件包进行统计分析。
2 结果
2．1 葡萄糖耐量试验
实验开始前及实验12wk时，模型组和灵芝孢子组大鼠均表现出糖耐量异常的变化(P<0．05)，餐后1h血糖显著增高(P<0．05)达到高峰，2h血糖仍较高；对照组大鼠餐后30min血糖达到峰值，2h血糖基本恢复正常，见（表1、2)。表1 实验开始前各组大鼠血糖水平(略)注:与对照组比较，*P<0．05。表2 实验第12wk各组大鼠进食后血糖水平(略)注:与对照组比较，*P<0．05；与模型组比较，#P<0．05。
2．2 血清胰岛素测定
实验结束时血清胰岛素变化，模型组升高(P<0．05)，而灵芝孢子粉组与对照组比较差异无显著性，见表3。表3 实验结束时各组大鼠血清胰岛素变化(略)注:与对照组比较，*P<0．05;与模型组比较，#P<0．05。
2．3 糖尿病大鼠肾脏线粒体和胞质Cyt-C、线粒体钙的变化
模型组线粒体Cyt-C含量明显低于对照组(P<0.05)，胞质Cyt-C含量明显高于对照组(P<0．05)；灵芝组线粒体Cyt-C含量高于模型组(P<0.05)，胞质Cyt-C含量明显低于模型组(P<0.05)，与对照组相比差异无显著性(P>0.05)；模型组线粒体钙均显著低于对照组和灵芝孢子粉组(P<0.05)，对照组与灵芝组比较差异无显著性(P>0.05),见表4。表4 大鼠肾脏细胞线粒体和胞质Cyt-C、线粒体钙含量(略)注:与对照组比较，*P<0．05;与模型组比较，#P<0．05。
3 讨论
2型糖尿病是胰岛素抵抗和B细胞的功能缺陷，血清胰岛素水平接近正常或偏高，但血中胰岛素却不能有效地控制血糖水平，因而表现糖耐量异常；靶组织对胰岛素反应不敏感甚至出现抗性；临床上大多数2型糖尿患者常伴有肥胖。本实验选用Wistar大鼠通过腹腔注射少量的STZ破坏少量的胰岛B细胞，再喂以高热量食物持续喂养10周，使过多能量堆积使动物肥胖，致使胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗，从试验数据可见动物出现葡萄糖耐量异常及血清胰岛素水平升高，类似人的2型糖尿病［4］。
糖尿病肾病早期肾小球细胞增生伴细胞外基质增多，此时机体通过凋亡来清除过度增生的细胞是有益的，病理状态下细胞凋亡过度致功能损害，细胞数递减往往与肾功能恶化程度成正比［5］。细胞色素C是以铁卟啉为辅基的蛋白质，是线粒体内膜外侧的外周蛋白，是线粒体呼吸链中传递电子的载体，在哺乳动物细胞凋亡信号传导过程的关键因素。线粒体在细胞存亡机制，一方面是由于线粒体膜间隙的Cyt -C释放至胞质后触发caspase级联，导致细胞死亡；另一方面，线粒体外膜上的Bcl-2蛋白家族调Cyt-C从线粒体的释放［6］。大量证据表明［7～10］，Cyt -C从线粒体释放至胞质是引发凋亡的关键步骤。本试验模型组肾脏组织线粒体CytC含量减少，而细胞质的Cyt- C的含量增多，灵芝孢子粉组肾脏线粒体Cyt-C、胞质Cyt-C含量与对照组比较差异无显著性，结果提示灵芝孢子粉可能通过减轻2型糖尿病大鼠肾脏线粒体膜的脂质过氧化作用，改善线粒体的氧化磷酸化过程和正常能量代谢，减少线粒体Cyt-C释放从而减轻了肾脏组织的损害。
Ca2+作为公认的细胞内第二信使，在细胞凋亡中充当了传递凋亡信号的角色。细胞钙稳态失衡是细胞凋亡的重要机制之一。胞质钙离子浓度上升可以引起一系列反应：激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，激活Ca2+依赖的谷氨酰胺转移酶，活化核转录因子等触发细胞凋亡。线粒体是细胞的钙储存库和调节器，线粒体内、外膜之间的通透性转换孔（PTP）、bc1-2形成的通道及线粒体膜上的转运体起维持线粒体钙稳态的作用。正常情况下，绝大数PTP处于关闭状态。当线粒体跨膜电位在各种凋亡诱导因素的作用下降低时PTP开放，导致线粒体膜通透性增大，使细胞凋亡启动因子如Cyt-C等、凋亡蛋白酶激活因子和凋亡诱导因子等从线粒体释放出来。在Ⅱ型糖尿病大鼠血清中自由基和抗自由基平衡破坏，自由基生成增加，线粒体膜通透性增大或破坏，胞质钙离子浓度上升，线粒体内膜跨膜电位下降，导致细胞凋亡。灵芝有降血糖、抗氧化、免疫调节作用，能提高体内超氧歧化酶活性，能消除体内产生的自由基。本实验模型组肾脏组织线粒体钙均显著低于对照组和灵芝孢子粉组(P<0．05)，对照组与灵芝组比较差异无显著性(P>0．05)，提示灵芝孢子可减轻对2型糖尿病大鼠肾脏线粒体氧自由基介导的线粒体膜结构与功能的损伤，对2型糖尿病大鼠肾脏具有保护作用。
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作者单位：1．佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007； 2．山西医科大学，山西 太原 030001.