米非司酮对宫颈癌Caski细胞凋亡的影响

【摘要】  目的 研究米非司酮对体外人宫颈鳞癌Caski细胞生长抑制情况,为临床应用米非司酮治疗宫颈鳞癌提供实验依据。 方法 体外培养人宫颈鳞癌Caski细胞,应用不同浓度的米非司酮处理，采用流式细胞术观察各组细胞凋亡率，并分析细胞周期的变化；异硫氰酸荧光素(FITC)荧光标记流式细胞术(FCM)法测定米非司酮对Caski细胞HPV-E6、p53、 Bcl-2和Bax的表达和活性变化。 结果 流式细胞术结果显示12.5mg/L以上浓度的米非司酮能明显诱导Caski细胞凋亡，使细胞周期阻滞于G1期，呈明显的浓度－时间依赖方式,而1.25mg/L浓度对Caski细胞无明显的诱导凋亡作用; FITC荧光标记FCM法结果显示米非司酮作用于Caski细胞后，HPV-E6、Bcl-2蛋白表达下调，p53、Bax蛋白表达上调，呈浓度依赖方式（P＜0.05）。 结论 大剂量米非司酮（12.5～20mg/L）具有诱导Caski细胞凋亡作用，能使其周期阻滞于G1期，与下调HPV16-E6、Bcl-2蛋白表达，上调p53、Bax蛋白表达有关。

【关键词】  米非司酮;宫颈癌;Caski细胞；凋亡

米非司酮是一种孕激素和糖皮质激素受体拮抗剂, 研究发现，米非司酮对体外人宫颈鳞癌细胞有生长抑制作用［1］，但其机制尚不清楚。本课题研究米非司酮对人宫颈鳞癌Caski细胞凋亡的影响,国内外鲜见相关报道，以期为临床应用米非司酮治疗宫颈鳞癌提供实验依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  人宫颈鳞癌细胞株Caski细胞，购自中国典型培养物保藏中心，置于含10%胎牛血清的RPMI-1640全培养液于37℃，95％湿度， 5％CO2的培养箱中培养。米非司酮原粉购自美国Sigma公司,用无水乙醇溶解,配成10mg/ml浓度，置-20℃保存，临用时以RPMI-1640全培养液稀释至所需浓度，使乙醇终浓度≤0.2%(v/v)。RPMI-1640培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司。鼠抗人HPV16/18E6购自福州迈新生物技术开发有限公司。鼠抗人Bax、鼠抗人Bcl-2、鼠抗人p53，异硫氰酸荧光素（FITC）荧光标记山羊抗鼠IgG，鼠二步法PV检测试剂盒，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。其它试剂为国产分析纯产品。

　　1．2  方法

　　1．2．1  米非司酮对Caski细胞周期和凋亡的影响  取对数生长期细胞，制成单细胞悬液，接种于75ml培养瓶中，每瓶4.5ml细胞悬液，含细胞5×107个。置37℃，95％湿度，5％CO2的培养箱中培养4h细胞贴壁后，加入含药物的培养液，实验分为三组：（1）空白对照组（2）溶媒对照组（3）米非司酮组(1.25、12.5、16.0、20.0mg/L)培养24、48、72h，收集细胞，每瓶含1×106个细胞以上，PBS洗两遍，弃上清液，用70％乙醇固定，过夜，PBS洗3次后经0.5g/L的RnaseA消化30min，终浓度65mg/L的碘化丙啶（Propidium  iodidu, PI）染色1h后上流式细胞仪（型号为FACS420）测定，分析细胞周期，计算细胞凋亡率。

　　1．2．2  FITC荧光标记FCM法测米非司酮对Caski细胞E6，P53, bcl-2，bax,蛋白表达的影响  用1.2.1方法收集对数生长期细胞,调整细胞密度5×107个。置37℃,5％CO2培养箱中培养4h细胞贴壁后，加入含药物的培养液，分为三组：（1）空白对照组；（2）溶媒对照组；（3）米非司酮组（1.25、12.5mg/L）。培养24h后，收集细胞，用4％多聚甲醛固定，4℃过夜，PBS洗3次，在4℃条件下，分别加入一抗（E6，P53, bcl-2，bax）作用30min，PBS洗两次，加入荧光二抗，作用30min，PBS洗两次，上流式细胞仪测定。

　　1．3  统计学处理  各组实验结果以均数±标准差（x±s ）表示，采用Spss Windows 11.5软件One Way ANOVA(单向方差分析)，P<0.05为统计学显著性意义。

　　2  结果

　　2．1  米非司酮对Caski 细胞凋亡的影响  Caski细胞溶媒组与空白对照组及1.25mg/L米非司酮组凋亡率无显著差异(P＞0.05)。米非司酮 （12.50、16.00、20.00mg/L）可使Caski 细胞发生凋亡，凋亡率随药物浓度的增高而增高、随作用时间的延长而增高，呈药物浓度－时间依赖性（P＜0.05)。Caski细胞溶媒组与空白对照组及1.25mg/L米非司酮组细胞周期各时相无显著差异(P＞0.05)，米非司酮（12.50、16.00、20.00mg/L）浓度组作用于Caski 细胞使其G0/G1期细胞比例增加，同时S期细胞比例减少，且随着药物浓度及作用时间的增加，此种影响更加明显（P＜0.05）,见表1。

　　表1  不同时间及不同浓度的米非司酮对Caski细胞凋亡、细胞周期的影响（略）

　　2．2  FITC间接免疫荧光标记流式细胞术检测米非司酮对Caski细胞凋亡相关蛋白表达影响  正常生长的Caski细胞有E6、P53、Bcl-2、Bax蛋白的表达，Caski细胞溶媒组与空白对照组上述蛋白的表达无显著差异(P＞0.05)，RU486能下调E6、Bcl-2蛋白的表达，上调P53、Bax蛋白的表达，且呈量效关系(P＜0.05),见表2。

　　表2  米非司酮对Caski细胞E6、P53、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响（略）

　　3  讨论
   
　　在全世界范围内, 宫颈癌是发病率和死亡率仅次于乳腺癌的最常见女性恶性肿瘤,超过80%的新诊断病例发生在经济不发达国家。宫颈癌主要的治疗方法是手术和放疗，近年来，化疗也受到重视，并取得较好的效果。作为一种全身治疗手段，化疗在宫颈癌高危病例和晚期复发转移患者的治疗中是不可或缺的，可更好地提高局部和远处转移控制率，提高长期生存率和改善生活质量。单药化疗中以顺铂的研究最广泛，疗效最肯定［2］。但顺铂的毒副反应和肿瘤细胞的耐药性使宫颈癌的化疗效果不理想，因此找到一种低毒、安全、副反应小、高效的抗肿瘤活性的药物极为必要。米非司酮是一种孕激素和糖皮质激素受体拮抗剂,最先由法国Roussel-Uclaf公司于1981年合成，在临床上最先作为一种终止早孕的药物广为应用。随着研究的不断深入，其抗肿瘤活性逐渐引起重视。米非司酮在妇科肿瘤的治疗中，对宫颈癌研究目前尚处于体外实验室阶段。
   
　　本实验通过FCM周期分析显示，米非司酮作用48h后，Caski细胞周期变化明显，随米非司酮作用浓度的增加，Caski细胞G0／G1期细胞比例逐步增加，S、 G2／M期细胞比例逐步减少，提示米非司酮可使Caski细胞阻滞于G0／G1期，有浓度依赖性。米非司酮可使Caski 细胞发生凋亡，并可见凋亡率随药物浓度的增高而增高，16mg/L 米非司酮作用于Caski细胞24、48、72h凋亡率分别为9.72%、12.69%、17.40% ，即凋亡率随米非司酮作用时间的延长而增高，呈药物浓度－时间依赖性P＜0.05。FITC间接免疫荧光标记流式细胞术结果显示经米非司酮（1.25、12.5mg/L）作用24h后，Caski细胞的E6、Bcl-2 蛋白表达下调，p53 、Bax蛋白表达上调，Bcl-2/Bax降低，且呈浓度依赖性。
   
　　目前认为HPV是导致宫颈癌发生最主要的因素，且高危型HPV（16、18型等）与宫颈癌关系十分密切［3～5］。HPV16致宫颈疾病恶变的机制主要与两个早期开放读码框架E6/E7编码的早期原癌蛋白E6/E7密切相关。HPV16编码的E6原癌蛋白与p53结合，形成蛋白复合物，导致p53降解，失活，破坏了p53介导的细胞对DNA损伤的反应。同时E6也抑制p53介导的细胞凋亡［6,7］。本实验显示未经米非司酮处理的Caski细胞表达E6原癌蛋白99.7%; p53 10.7%, 经米非司酮处理后与对照组比较，E6蛋白表达明显下调，随着药物作用浓度的增加，E6蛋白的表达下降得越多；p53蛋白表达明显上调，亦显示出浓度依赖性。Caski细胞出现明显的凋亡率增加。
   
　　Bcl-2是凋亡抑制基因，Bax是Bcl-2家族中的成员，其作用与Bcl-2相反，是促进细胞凋亡基因。Bcl-2与Bax在体内是通过二聚体而发挥作用的。Bax/Bcl-2下降，抑制凋亡，Bax/Bcl-2升高，促进凋亡。宫颈癌中Bcl-2过度表达，Bax表达减少，使细胞凋亡受到抑制。癌抑制基因p53通过控制增生细胞由细胞周期G1期向S期移行而参与细胞凋亡的诱导，它能抑制Bcl-2的转录而活化Bax的转录，通过调节两者的比率来控制细胞增生，并以细胞凋亡的方式清除异常的细胞［8～10］。本实验显示，正常生长的Caski细胞表达Bcl-2、Bax 蛋白，经米非司酮处理后，Bcl-2蛋白表达明显下调， Bax蛋白表达明显上调，显示出浓度依赖性， Bcl-2/Bax降低，促进Caski细胞凋亡。
   
　　综上所述，米非司酮对人宫颈癌Caski细胞诱导凋亡的机制之一可能与下调Caski细胞的E6、Bcl-2 蛋白表达，上调p53 、Bax蛋白的表达，Bcl-2/Bax比值降低有关。目前临床上广泛而合法地使用米非司酮仍局限于终止早孕阶段，主要为口服给药，国内市场上亦只有口服片剂。按照常规剂量100mg/d,其血药峰值为1.25mg/L,本实验结果显示，在此浓度，无明显诱导凋亡作用。如仅通过口服片剂，还达不到有效药物作用浓度。因宫颈癌是一种可直接肉眼观察到的恶性肿瘤，因此我们可以改变用药途径，如在局部使用：病灶处及其周围涂抹、注射，或使用介入治疗等都可以达到有效浓度，诱导宫颈癌细胞凋亡。因此认为米非司酮有望成为一类毒副作用小，有效的，新型的临床治疗宫颈癌的化疗药物之一。

【参考文献】
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　　［9］ Rowan S,Fisher DE.Mechanisms of apoptotic cell death Lcukemia,1997,11:457～465.

　　［10］ Miyashita T,Reed JC. Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene［J］.Cell,1995,80:293～299.

作者单位：深圳市第四人民医院妇产科,广东 深圳 518033; 南华大学附属一医院妇产科,湖南 衡阳 421001.