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【摘要】 目的 观察绿茶多酚及针刺小鼠百会穴对c57小鼠行为学和脑多巴胺含量的影响,探讨绿茶多酚和灸百会穴对百草枯损伤的c57小鼠保护作用及其机制。 方法 c57小鼠65只,分为空白对照组、阳性对照组、绿茶多酚组、针刺小鼠百会穴组、及绿茶多酚百会穴联合5组。除空白对照组外其他4组均给予相同剂量的百草枯，采用爬杆法测量小鼠行为学改变,应用高压液相电化学法测定脑多巴胺(DA)含量。 结果 空白对照组和给予防护干预剂的小鼠行为改变与阳性对照组相比均有统计学意义(P＜0.05)，但测得的各组的多巴胺含量没有差异（P＞0.05）。 结论 绿茶多酚及针刺小鼠百会穴对百草枯损伤c57小鼠行为的影响有一定的保护作用，但作用机制有待于进一步探讨。
【关键词】 百草枯;多巴胺;纱茶多酚；帕金森病；小鼠；针灸
随着生物－心理－社会的医学模式的建立，人们更为关注对环境危害较小的医疗方法．因而探索我国传统医学方法和常用饮品绿茶中的植物提取物等也用来治疗西医上比较棘手的疾病。Paraquat(百草枯) 是一种广泛应用的除草剂,它的结构与MPTP非常类似,有接触Paraquat数年后出现年轻帕金森病（PD）病例的个案报道,所以一直成为PD病因研究的热点.大量实验证实,绿茶多酚有效成分表没食子儿茶素没食子酸酯［(-)2ep igallocatechin 232 gallate, EGCG］对神经毒性物质及缺血、缺氧等多种损伤引起的神经损害均具有保护作用［1,2］,而在祖国传统医学中，百会穴是脑病治疗的常用穴位，它有醒脑开窍、熄风、止晕、抗抽搐的功用，针灸常用于中风、头晕、震颤，预防、治疗老年性痴呆，增加记忆力减退的治疗。本文主要探讨这两种方法是否可以影响Paraquat引起的类PD行为。
1 材料和方法
1.1 动物分组 雄性C57bl/6小鼠(由新疆医科大学动物中心提供,6周龄大小)65只,18～22g,随机分为5组,空白对照组为9只，其余4组14只: ①阳性对照组; ②给予绿茶多酚组; ③灸百会穴；④绿茶多酚+灸百会穴；⑤空白对照组;除空白对照组外，每组小鼠每日喂食相应的百草枯10mg/kg, 另给②组绿茶多酚200mg/kg, ③组每周刺激白会穴2次，余组给予等量生理盐水,共2个月。同样条件下饲养, 光照12/12h明暗交替,室温饲养。并观察小鼠的自发性行为的改变。
1.2 爬杆实验 实验2个月后，用爬杆法进行评定小鼠行为学改变［3］，先引导动物在10s内自杆顶爬至杆底,每只训练4次,训练完毕对其进行测定。进行爬杆试验,每只鼠允许爬杆两次,计算平均分。爬杆实验用直径35mm、高1 000mm的光滑不锈钢管,垂直竖立,将大鼠头向下放置在金属杆的顶部,使其沿杆自然爬下,观察动物在下行过程中的行为,并按标准计分,评分标准如下:四肢并用,一次顺利从杆上爬下为0分;一步一步螺旋向下爬行但兼有后肢滑行行为的为0.5分;上杆后间歇停顿数次后爬下,但可抱紧金属杆为1分;滑行后掉落为1.5分;不能抓杆,直接掉落为2.0分。
1.3 DA含量的测定于爬杆实验后，断椎法处死,取全脑,置于匀浆器中,加入1.5ml预冷的氯乙酸,制成匀浆。置于台式冷冻离心机中15 000×g离心30min,留取上清液,运用高压液相电化学法测定多巴胺(DA)。检测器: UV 254nm,色谱柱为25cm×0.46cm Spherisorb C18,检测器工作电压为0.7V,检测灵敏度为10nA。流动相:甲醇/水(75/25),固定相: 5u C18;标准品进样量:10μl,样品进样量: 20μl;样品处理液:0. 1 MHCLO4处理液;溶剂:甲醇;流速:1.0ml/min。
1.4 试剂与仪器 多巴胺标准品(Sigma公司产品),使用前先用无水乙醇溶解,然后加生理盐水稀释, 浓度5mg·ml-1,氯乙酸、多巴胺(Dopamine,DA)为Sigma公司产品,其余试剂为国产分析纯试剂。高效液相-电化学检测系统:Waters6000A恒流泵(日本岛津公司)、Rheodyne六通阀(美国)、BASLC24B电化学检测器(美国)及YEW TYPE 3066 记录仪(日本);手用匀浆机(上海);台式高速离心机(Sigma公司)。
1.5 统计分析 实验数据应用SPSS统计软件处理,用均数±标准差表示,多组间比较采用方差分析，不满足方差齐性的用秩和检验。
2 结果
2.1 行为学观察 各实验组小鼠于持续接触低剂量百草枯1wk后出现震颤、前腿抬高、竖尾、竖毛，紧跟着出现短暂性的活动减少，对外界刺激反应低下等类似帕金森病的症状，以给予百草枯后2h左右上述症状最为明显。上述症状仅为短暂性，可自行恢复，至24h后完全消退。随着染毒时间的延长，上述表现越来越明显，症状持续时间逐渐增长，但仍然能于次日恢复。最后一次灌胃完毕后，百草枯组小鼠活动少，后腿僵直，症状几乎持续存在，其它各试验组虽也存在上述症状，但不如百草枯组明显，且均可在某种程度上自行恢复，从爬杆试验的时间可看出，各实验组小鼠爬杆试验时间没有统计学意义（详见表1）。灸百会穴组的平均得分最低（除阴性对照组外，为0分），其次为绿茶多酚组，灸百会穴+绿茶多酚组位列第三，从第1wk至第8wk的得分来看：除阴性对照组外，各实验小组的小鼠得分为进行性增高的过程，由小鼠爬竿试验评分的统计学比较结果（详见图1），可以看出：与百草枯组相比较，绿茶多酚组、灸百会穴组、及绿茶多酚+灸百会穴组的实验小鼠的爬竿评分均有统计学意义，（P绿茶多酚＜0.01，P灸百会穴＜0.01，P绿茶多酚+绿茶多酚＜0.01）以灸百会穴组的差异最为明显，表明绿茶多酚及灸百会穴对于改善PQ损伤所致的类帕金森症状有一定的效果。
表1 各实验组小鼠爬竿时间（略）
注：w代表周，试验从第1wk至第8wk结束时，5组小鼠爬竿时间差异物统计学意义（F=1.08，P=0.355）。
图1 C57小鼠爬杆实验评分测定结果（略）
注：1组为百草枯组、2组为绿茶多酚组、3组为灸百会穴组、4组为绿茶多酚+灸百会穴组、5组为阴性对照组。
2.2 C57小鼠脑内多巴胺含量测定 C57小鼠脑内多巴胺含量以阴性对照组最大，百草枯组的均数值最小，但经过统计学检验，各试验组多巴胺含量的差异无统计学意义，与病理切片HE染色所见不太一致，可能和试验中后期由于小鼠死亡，样本量减少有关，试验周期仅为2个月，亦可能是在此期间还不足以引起多巴胺能神经元明显减少。详见表2。
表2 C57小鼠全脑DA含量（略）
注:F=3.72,P=0.45。
3 讨论
中枢神经多巴胺能神经元以中脑黑质致密部(Substantia nigra compact, SNC)最为集中,纹状体内多巴胺含量极高,约占全脑的60%～70%［4,5］。实验表明,当多巴胺能神经元减少40%～60%时,DA神经无活性下降,可导致Parkinson's病理改变和临床症状［6,7］。在氧化应激状态下,DA通过非酶促反应进行代谢,并产生超氧阴离子(O2-),羟基(OH-)和羟自由基(·OH) , 损伤多巴胺神经元［7］。绿茶多酚可提高D2半乳糖与Aβ 25～35诱导的拟AD模型小鼠全身性抗氧化能力,改善氧化应激损伤引起的细胞内钙超载作用［8］。有证据表明腹腔注射MPTP后,经血脑脊液屏障被胶质细胞摄取并转移到DA神经元,通过抑制DA神经元线粒体功能和引发氧化应激,导致DA神经元凋亡,这一过程和机制与多巴胺神经元的自身氧化应激损伤相似［6］。Paraquat(百草枯) 是一种广泛应用的除草剂,它的结构与MPTP非常类似, 近年有研究者认为长期给予低剂量百草枯 (5～10mg·kg-1体重),其慢性毒性作用主要是对基底神经节造成损害而不产生肺毒性作用,故百草枯的神经毒性作用亦被广泛研究。近年来对绿茶多酚的药理作用的研究越来越多,尤其是其抗氧化及清除自由基的作用受到重视［9］。而针刺治疗中风和其他相关疾病取得良好临床疗效的主要机制是：通过针刺前后不同时间测定血浆中自由基、lpo（过氧化脂质）、PGI2（前列腺素）、TXA2（血栓素A2）、cAMP等水平的研究表明，针刺是通过消除中风机体内的自由基、LPO调节机体内的花生四烯酸系统平衡，提高PGI2，抑制中风患者体内已存在的血小板聚集，降低血液粘滞性，以及减少血管痉挛等途径来发挥作用的。另有实验证明：针刺可以对中脑导水管周围灰质内的多巴胺受体有影响，动物、特别是高等哺乳类动物，与人类在形态结构、组织解剖、生理生化、病理、免疫等方面都有许多共同之处，他们之间在神经系统，消化系统、泌尿生殖及内分泌系统等方面的相似点大于差异点，人类所具有的的组织结构在高等哺乳类身上基本相同。因此，既然穴位与经络是机体的一种功能系统，那么除人类以外，动物的穴位与经络估计也会以某种形式存在。
在中国兽医学中，针灸疗法是其重要组成部分，用针、炙、烙、放血等刺激作用于动物体表的特定穴位，可调整畜禽的生理功能而达到治疗疾病的目的。有资料报道针灸疗法用于10多种畜禽的各类疾病的治疗，有效率达到89.2%，而这些体表特征部位也就是畜禽穴位。因此，从兽医针灸来看，动物与人类一样存在着穴位。
从实验结果来看绿茶多酚和针刺百灰穴对于c57小鼠运动行为方面有明显的保护作用。虽然本文结果显示, Paraquat复制PD动物模型前脑组织DA、各组之间没有明显差异(P>0.05),与文献报道不一致。分析其原因：在临床上往往有些PD病人的行为学变化和影象学的严重程度之间也并不总是正相关，另外本实验采用的并不是传统的经腹腔注射给药，可能亦是影响的因素之一，限于实验本身属于亚慢性动物实验，时间稍长，百草枯另外的一个靶器官是肺，容易造成急性肺水肿，使小鼠死亡［10］，并且死亡时间大多在实验进行到1～2月之间，所以实验中间死亡的小鼠而最后造成动物数少，也可能是实验结果为阴性的原因，同时也不排除经口服途径给予百草枯在2个月内不能造出PD模型的可能，需进一步的实验证实。令人感到兴奋的是：在灸百会穴组，从实验开始到结束，没有发生一只小鼠死亡，且在爬杆实验里评分最低，客观的反映百会穴作为全身阳气的会聚点，对于提高整个机体的相互协调有其显著的作用。使用绿茶多酚，小鼠鼠行为学同阳性对照相比也有改善,说明绿茶多酚对Paraquat氧化应激损伤具有保护作用。Cyt c可特异地与Apaf21结合并促进其寡聚化,募集多个caspase29分子,形成“凋亡体(apotosome) ”,引起caspase29的变构并活化,进而激活下游效应分子,诱导凋亡［11］。通过免疫细胞化学染色发现, PQ作用后cyt c在胞浆内的表达增强,细胞染色较正常组深,着色细胞多,细胞形态改变,而EGCG预处理可抑制cyt c的过表达,改善细胞形态。这说明EGCG的神经保护作用可能与维持线粒体功能及调节凋亡相关蛋白的表达有关。EGCG对PQ诱导的细胞损伤具有一定的保护作用, 其作用机制可能与下调凋亡效应蛋白cyt c在胞浆中的过表达有关［12］，同时使用两种保护措施并未如预想的那样取得更好的效果，表明两者之间相互作用较复杂，至少不存在协同作用。
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作者单位：新疆医科大学28期科研一班,新疆 乌鲁木齐 830054.