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【摘要】 目的 观察不同品系小鼠感染华支睾吸虫后，血清中特异性抗体IgG、IgG1/IgG2a的动态变化。 方法 NaOH消化法粪检虫卵，ELISA法测定不同品系小鼠感染后4、8和12w 血清中抗体IgG、IgG1/IgG2a的动态变化。 结果 三个品系小鼠血清IgG均于感染后第4～8w升高，约在第10w达到高峰，此后开始下降并维持至观察结束的第12w；IgG1/IgG2a比值感染后逐渐增高，并持续至第12w。 结论 华支睾吸虫感染的免疫应答发生了由Th1免疫应答向Th2免疫应答转变的趋势。
【关键词】 华支睾吸虫；小鼠；抗体；IgG；IgG1；IgG2a
华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）俗称肝吸虫（Liver fluke），成虫寄生在人的肝胆管内，造成胆管扩张及胆管上皮增生，严重时可引发胆管炎、胆道结石、肝硬化等合并症。该病在我国流行广泛，严重危害人类健康。研究表明，在寄生虫感染的免疫应答过程中，辅助性T细胞（T helper,Th）处于核心位置，决定免疫特异性及发生何种免疫应答。Mosmann等人于1986年首先发现小鼠CD4+T细胞在抗原刺激下可分化为Th1/Th2两个亚群，分别分泌不同类型的细胞因子，其中Th1细胞主要介导细胞免疫和小鼠IgG2a亚类抗体的产生；Th2细胞主要介导体液免疫和小鼠IgG1抗体的产生。1991年，Romagnani证实人体亦存在Th1细胞和Th2细胞两个亚型，继而Th1型和Th2型免疫应答在寄生虫感染中的作用受到重视。宿主感染曼氏血吸虫、疟原虫和囊虫后，机体发生由Th1型免疫应答向Th2型免疫应答的转变，华支睾吸虫感染FVB和BALB/c小鼠Th1/Th2型细胞因子水平发生变化［1］，提示不同的Th1/Th2优势应答类型在感染性疾病的发生、发展与转归中起着重要的作用［2］。本实验选用国内实验室常用的不同品系小鼠比较观察感染华支睾吸虫后血清特异性IgG及IgG1/IgG2a的动态变化，旨在了解其免疫应答特性，为深入探讨其致病机制提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物及材料
1.1.1 动物 健康清洁级小鼠BALB/c、C57BL/6、昆明鼠各30只，6～8周龄，体重20～30g， SPF级环境喂养。健康豚鼠，雌雄各5只，体重(500±20)g。均由徐州医学院动物实验中心提供。自疫区购买感染华支睾吸虫囊蚴的麦穗鱼。
1.1.2 试剂 辣根过氧化物酶（HRP）标记Goat Anti-Mouse IgG购自武汉博士德生物工程有限公司；HRP标记IgG1、IgG2a购自Santa Cruze 公司。
1.2 动物模型的建立及血清样本的采集
1.2.1 动物模型的建立 从流行区购买麦穗鱼，按常规方法［3］分离囊蚴并计数。三个品系的小鼠均随机分为实验组及对照组，实验组小鼠24只，又分为轻、中、重感染组，每组8只，感染囊蚴的数量分别为10个/鼠、20个/鼠、30个/鼠。将已分离的纯净囊蚴按上述感染剂量经口灌入小鼠胃内，再用适量生理盐水冲洗，以保证囊蚴的饲入。各品系对照组小鼠6只，采用生理盐水灌胃。
1.2.2 血清样本的采集 感染前、感染后第4w、8w和12w自小鼠眼内眦窦采血，分离血清，-20℃冻存备用。另于感染的第10w对部分小鼠眼内眦窦采血。
1.3 水溶性抗原的制备 将自疫区购买的阳性麦穗鱼按常规方法分离囊蚴并计数。经口感染豚鼠10只，每只感染囊蚴250个。感染后50d处死动物，从肝脏中取出虫体，用无菌生理盐水冲洗数次，洗去虫体表面粘附的胆汁、粘液和血液。抗原制备参考常规方法［4］，将成虫充分研磨成匀浆，加入生理盐水，经反复冻融，4℃冰箱内冷浸2～3d，其间摇动数次。而后冰浴中，用振幅为10μm超声处理（英国Sanyo Soniprep150型超声波破碎仪）10s，反复5次，每次间歇50s。粉碎后，同上冷浸72h， 12000rpm，4℃离心10min，上清液即为华支睾吸虫成虫抗原。以分光光度仪（德国Eppendorf Biophotometer）测定蛋白含量，-20℃冻存备用。
1.4 特异性抗体检测 采用间接ELISA法，用棋盘滴定法确定最佳抗原包被浓度。4℃包被抗原（0.05mol/L pH9.5碳酸缓冲液）过夜；用1%小牛血清封闭，37℃，30min；加入稀释的小鼠血清，37℃孵育1h；再加稀释的HRP标记二抗，37℃1h。最后用二甲亚砜配置0.1mg/ml的TMB（3.3,5.5-四甲基联苯胺）进行显色反应，避光室温静置15～20min；2mol/L H2SO4终止反应，酶标仪（奥地利CliniBio 128C）测OD值（490nm）。每步反应后均用PBS-Tween（pH7.4）清洗3次，每次5min。检测IgG和IgG1、IgG2a所用抗原包被浓度分别为20μg/ml、40μg/ml、40μg/ml；血清稀释度分别为1：100、1：50、1：50；HRP标记二抗均为1：2 000稀释。每个血清样本均设复孔，取均数，对照组血清同等条件检测。感染组与对照组血清OD值的比值≧2.1判为阳性。
1.5 数据处理 以平均值±标准差(x±s)表示，数据比较作t检验。
2 结果
2.1 小鼠一般状况 对照组小鼠一般状况良好，体重增加明显，毛色有光泽，摄食活动正常。感染组小鼠感染5d后出现毛色灰暗，摄食减少，精神萎靡，其中感染30条囊蚴的BALB/c、昆明鼠出现竖毛现象。
2.2 粪便检查 实验组小鼠感染后20d即可在粪便中查到虫卵。小鼠粪检阳性率的比较：BALB/c、C57BL/6、昆明鼠三个品系各24只小鼠粪检虫卵阳性率分别为79.17%（19/24）、12.5%（3/24） 、37.5%（9/24）；经统计学处理，三个品系小鼠之间阳性率差异有统计学意义（χ2=21.48,P<0.005）。
2.3 血清IgG抗体动态变化 ELISA检测结果以相对值（OD值）表示，感染组小鼠血清IgG随感染时间延长相对值增大，并于感染后第4～8w升高，约在第10w达到高峰，此后有所下降并维持至观察结束的第12w。对同一感染度，以BALB/c小鼠血清抗体IgG的峰值最大，昆明小鼠次之，C57BL/6小鼠最低。检测结果表明，在0、4、8、10和12w各个时间点，三个品系小鼠血清IgG的量均随感染囊蚴数量的增加而增加（表1）。
表1 三种品系小鼠感染不同数量华支睾吸虫囊蚴后血清中特异性IgG水平的动态变化（略）
Table 1 Dynamic changes of the specific IgG level in the sera of BALB/c mice infected with various doses of Clonorchis sinensis metacercaria
注:(1)与正常组比较，P<0.05、P<0.01、P<0.001; (2)轻度与中、重度比较，△P<0.05、△△P<0.01、△△△P<0.001; (3)中度与重度比较，※P<0.05、※※P<0.01、※※※P<0.001。
(1)Compared with normal group,P<0.05、P<0.01、P<0.001; (2)light compared with moderate, heavy group,△P<0.05、△△P<0.01、△△△P<0.001; (3)moderate compared with heavy group,※P<0.05、※※P<0.01、※※※P<0.001.
BALB/c小鼠三个感染组血清IgG的相对值与正常组比较，4w、12w时的轻度（0.23±0.07，0.22±0.01）与各正常组（0.11±0.03，0.11±0.04）比较，差异不显著（P>0.05），其余均有统计学意义（P<0.05）。不同时间点，中度同重度感染组比较，差异不显著（P>0.05）；轻度同中、重度剂量感染组，差异均显著(P<0.001)。C57BL/6小鼠三个感染组血清的IgG相对值分别同正常组比较，4w时轻、中度及10w、12w时的轻度与各正常组差异不显著外，其余均有显著性差异（P<0.05）。各时间点轻度同中度剂量感染组比较，差异不显著（P>0.05）；轻度、中度同重度剂量感染组比较均于10w时差异显著（P<0.05），余差异无显著性，但是其IgG值随感染剂量的加大而增大。昆明小鼠三个感染组血清的IgG相对值分别同正常组比较，4w、8w时的轻度（0.18±0.11，0.30±0.08），及12w的轻、中度（0.13±0.04，0.25±0.03）与各正常组（0.06±0.13，0.10±0.09，0.07±0.01）比较，差异不显著，其余均有显著性差异（P<0.05）；轻、中度在4w、12w时差异不显著，中度和重度在8w、10w差异不显著，其余均有显著性差异（P<0.05）。
2.4 血清IgG1/IgG2a的动态变化 三个品系小鼠血清抗体亚类IgG1/IgG2a值，均随感染时间延长而增大，并持续至第12w。实验结果表明，在0、4、8、10和12w各个时间点，三个品系、三个感染组小鼠血清抗体IgG1/IgG2a值均随感染囊蚴数量的加重而增大(表2)：三个品系、三个感染组小鼠血清的IgG1/IgG2a比值分别与各正常组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；BALB/c小鼠10w轻、中度分别与重度比较差异显著（P<0.05），12w时三个感染组之间差异均显著（P<0.05）；C57BL/6小鼠12w时，轻度与重度比较差异显著（P<0.05）。其余包括昆明鼠在内，不同剂量之间的IgG1/IgG2a比值无显著性差异，但是其比值随感染程度的加重而增大。
表2 BALB/c小鼠感染不同数量华支睾吸虫囊蚴后血清中IgG1/IgG2a的动态变化（略）
Table 2 Dynamic changes of IgG1/IgG2a in the sera of BALB/c mice infected with various doses of Clonorchis sinensis metacercaria
注:(1)与正常组比较，P<0.05、P<0.01、P<0.001; (2)轻度与中、重度比较，△P<0.05、△△P<0.01、△△△P<0.001; (3)中度与重度比较，※P<0.05、※※P<0.01、※※※P<0.001。
(1)Compared with normal group, P<0.05、P<0.01、P<0.001; (2)light compared with moderate, heavy group,△P<0.05、△△P<0.01、△△△P<0.001; (3)moderate compared with heavy group,※P<0.05、※※P<0.01、※※※P<0.001.
3 讨论
Yoshimura［5］报道，用30～50个华支睾吸虫囊蚴感染小鼠，粪检阳性率为26.4％～100.0％。本实验用10～30个囊蚴感染BALB/c小鼠，粪检阳性率为79.17%，与上述结论相似。Yang Kyu Choi［1］和Byung-ⅡYOON［6］实验中用15个囊蚴感染小鼠，Jong In Kim［7］实验中以20个囊蚴感染小鼠，实验均获得成功。本实验为确定适合各品系小鼠的感染剂量，分别用10、20、30个囊蚴感染小鼠，并持续观察12w，未发生因感染剂量过大而致动物死亡的情况。30个囊蚴感染组粪检虫卵阳性率高，血清IgG水平明显高于10、20个囊蚴感染组，表明在进行动态观察小鼠宿主的免疫状态或病理变化时，30个囊蚴是一个较为适宜的感染剂量，亦进一步证明抗体的动态变化与宿主的感染度有一定的关系［8］。
宿主感染华支睾吸虫后，激活其免疫系统，诱导细胞及体液免疫应答。已有资料显示，家兔感染华支睾吸虫后，血清抗体滴度在感染后28d开始上升，于70～80d达高峰［9］。本实验观察发现BALB/c、C57BL/6、昆明鼠三个品系小鼠血清抗体IgG，于感染后4w逐渐上升，约在第10w达高峰，总体趋势与上述结论一致。Yang Kyu Choi等［1］研究结果表明 FVB小鼠比BALB/c小鼠更易感染华支睾吸虫囊蚴，说明不同品系小鼠对华支睾吸虫感染的敏感性存在差异。考虑动物模型的易于推广性，本实验选用国内常用的小鼠品系进行比较观察。三个品系小鼠在相同感染度的条件下，以BALB/c小鼠血清抗体IgG的峰值最大，昆明小鼠次之，C57BL/6小鼠最低。抗体检测结果表明BALB/c小鼠敏感性最高，昆明鼠次之，C57BL/6不敏感，与粪检结果相一致［10］。
机体在进行免疫应答的过程中，一般选择保护性应答方向，即选择消除抗原的免疫反应，这是长期进化过程中自然选择的结果［11］。自1986年Th1与Th2的概念产生以来，人们对其在机体免疫反应中的作用进行了大量的体内外研究，以表达IL-2、IFN-γ为代表的Th1亚群细胞具有增强杀伤细胞的细胞毒性作用，激发迟发型超敏反应，诱导单核因子产生，介导细胞免疫应答，诱导IgG2a产生；以表达IL-4、IL-5、IL-6和IL-10为主的Th2型细胞，可以促进肥大细胞和嗜酸性粒细胞的增值和分化，抑制单核因子产生，刺激B细胞分化、增殖和抗体产生，介导体液免疫应答，诱导IgG1产生。华支睾吸虫感染可明显影响宿主的细胞免疫功能，表现为辅助T（Th）细胞减少，尤其是Th细胞减少,而具有抑制功能的T 细胞（Ts）则相对增多，Th1处于一种低应答状态［12］。Choi.YK等［1］证实，小鼠感染华支睾吸虫后，其体内IL-4、IL-5、IL-10水平升高，且IgE水平显著升高，嗜酸性粒细胞增高。因此，可以认为华支睾吸虫感染后，能使机体Th1/Th2细胞因子水平失衡，免疫功能紊乱，并且细胞免疫功能低下有利于虫体存活。本实验观察了小鼠感染华支睾吸虫后血清IgG1/IgG2a比值的动态变化，结果显示各感染组小鼠血清抗体亚类IgG1/IgG2a比值于感染后第4w有所升高，并持续至第12w，提示了华支睾吸虫感染小鼠随时间的推移，发生了由Th1向Th2型免疫应答的漂移。这与一般认为的在蠕虫感染过程中，免疫保护作用基于Th2型细胞介导的体液免疫相符［2］。一些研究者在对华支睾吸虫感染病患者血清细胞因子水平研究时，也获得了类似的结论。当然，和其他寄生虫一样，华支睾吸虫感染的免疫平衡受感染周期、感染度及宿主之间差异的影响，其Th1/Th2免疫平衡变化也不尽相同。
Th1细胞产生的细胞因子和Th2相互作用，Th1型细胞因子下调伴随着Th2型细胞因子的激活，因此何种细胞因子占主导地位决定着免疫应答转变的方向。本研究提示，在华支睾吸虫感染初期可能主要引起一个以产生Th1型细胞因子为主的优势应答，随着感染时间的延长又主要以产生Th2型细胞因子为主的优势应答，使肝脏炎症反应逐渐减弱转为慢性肝吸虫病。深入研究华支睾吸虫感染免疫调节机制，尤其深入探讨Th1/Th2亚群在免疫应答中的不同生物学功能及其相互影响，可以为阐明其免疫调节提供理论依据，而且对深入了解由Th1/Th2介导的其他感染性疾病提供更广泛的实验依据。至于华支睾吸虫感染不同病程中是何种抗原刺激机体产生免疫状态的改变，还有待进一步研究。
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作者单位：徐州医学院病原生物学教研室, 江苏 徐州 221002.