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【摘要】 目的 探讨转化生长因子β（TGF β）Ⅱ型受体(TGF β RⅡ)在尖锐湿疣（CA）皮损中表达情况及其意义。 方法 采用半定量PCR技术分别检测20例CA皮损及10例正常对照包皮中TGF β RⅡ的mRNA的表达。 结果 CA皮损中TGF β ⅡR的mRNA的表达水平显著低于正常对照包皮组织（P＜0.05)。 结论 TGF-β信号通路中TGF-β RⅡ表达的下降可能与CA疣体的发生相关。
【关键词】 尖锐湿疣；转化生长因子β；Ⅱ型受体;转化生长因子β
转化生长因子β（Transforming Growth Factor β，TGF-β）是一种公认有效的上皮细胞生长抑制因子，而TGF-β的Ⅱ型受体（TGFβRⅡ）是TGFβ信号通路转导中较关键的受体，它们的相互作用，在上皮细胞肿瘤的发生和发展方面发挥着重要的作用［1］，尖锐湿疣（Condyloma acuminatum ,CA）是人乳头瘤病毒（HPV）感染的性传播疾病，也是一种表皮的良性肿瘤，具有迁延不愈、顽固难治等特点。我们既往的研究已经表明TGF-β在CA皮损中的表达水平是显著上升的［2］，但它的上升却未能发挥对CA皮损上皮细胞的生长抑制作用，为了更深入的探索TGF-β在CA发病中的作用，我们采用了半定量PCR技术进一步检测了CA皮损及正常包皮组织中TGF β RⅡmRNA的表达和意义，以探讨TGF-β的信号转导通路在CA发病中的作用。
1 材料与方法
1.1 标本来源 在皮肤科门诊收集CA患者20例，临床皮损典型并经病理证实，其中男12例，女8例，平均年龄35岁，平均病程5.2月，既往未接受任何治疗，无其他相关系统性疾病。10例正常男性包皮取自接受包皮环切术的个体，平均年龄26岁。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂 RNA提取试剂盒以及PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，逆转录试剂盒购自日本东洋纺公司，PCR引物由上海生工代为合成。
1.2.2 标本收集 每一标本取材后均立即分成两份，一份置于10％甲醛磷酸缓冲液中固定后，按常规脱水、透明、石蜡包埋进行病理确诊，另一份立即放入液氮冻存备用。
1.2.3 组织总RNA提取 参照（TaKaRa公司）说明书要求从组织中抽提总RNA。用UV-2201型紫外分光光度计（SHIMADZU，日本）测定所提RNA的纯度及含量，A260/A280比值均在1.8～2.0之间。另取适量RNA进行琼脂糖凝胶电泳验证所提RNA质量。
1.2.4 逆转录合成cDNA 参照逆转录试剂盒（TOYOBO公司）说明进行，反应体系轻微离心后，置于GeneAmp 2700型PCR仪（美国）中，反应条件为：42℃ 30min、99℃ 5min，所得cDNA产物保存于-20℃冰箱待用。
1.2.5 引物设计 以18s rRNA作为内参基因。TGF-β RⅡ引物,上游：5’-GCAGGTGGGAACTGCAAGAT-3’，下游：5’-GAAGGACTCAACATTCTCCAAATTC-3’，扩增产物75bp；18s rRNA引物,上游：5’-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3’,下游：5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3’,扩增产物112bp。
1.2.6 半定量PCR及其结果判定 取转录产物cDNA 1.5μl，上下游引物各0.5μl，Premix Taq酶12.5μl，加灭菌蒸馏水10μl至总反应体积为25μl。混匀，离心，以矿物油覆盖，置GeneAmp 2700型PCR仪（美国）中，95℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s 72℃ 60s，共35个循环；72℃ 7min。每一样本均设置以蒸馏水为模板作阴性对照。1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外线下观察，PCR产物片段大小与预期的相一致。对结果照相后进行计算机灰度扫描，采用BandScan5.0图像分析软件进行电泳条带的平均光密度（OPTDM）和发光面积（AREA）的测定。PCR产物的含量用电泳条带的累光密度（OPTDI）的数值表示（OPTDI=OPTDM×AREA）。TGF-β RⅡ的相对含量以同一标本的18s rRNA的PCR产物含量的比值来表示，即OPTDITGF-β RⅡ/ OPTDI18s rRNA。
1.3 统计学处理 采用t检验，用sas8.0统计分析软件进行统计学处理。P＜0.05视为差异有统计学意义。
2 结果
20例CA、10例正常对照包皮组织均能扩增出TGF-βRⅡ目的片段以及18s rRNA内参片段，阴性对照不能扩增出特异片段，PCR产物电泳结果见图1。CA皮损中TGF-βRⅡmRNA的相对含量为0.659±0.116 ，包皮组织中为0.837±0.076，两两比较差异有统计学意义(χ2=3.758，P＜0.01)，TGF-β RⅡ mRNA在两组间的表达差异有统计学意义，从转录水平来看，在CA皮损中TGF-β RⅡ的表达水是平明显下降的。
图1 半定量PCR检测TGF-β RⅡ mRNA在CA组及包皮组中的表达（略）
M为DNA标准参照物；1～2：CA皮损；3～4：正常包皮；1,3：TGF-β RⅡ（75bp）；2,4：18s rRNA（112bp）
3 讨论
TGF-β1是一种多功能的细胞因子，广泛参与细胞生长、分化、凋亡以及血管生成，细胞外基质的形成等，与免疫抑制及肿瘤形成等病理过程密切相关［3］。研究认为，TGF-β1发挥生物学效应，有赖于与效应细胞表面受体正常结合并启动一系列的级联信号反应，目前比较明确的TGF-β受体有三型，其中TGF-β RⅡ是唯一能够通过自身磷酸化而被激活的丝苏氨酸蛋白激酶受体，对TGF-β信号通路的正常启动具有关键作用［3］。TGF-β1的正常启动和活化将可有效的抑制上皮细胞的生长，维持表皮内环境的稳定，抑制上皮细胞肿瘤的发生和发展［2］。研究已经发现，在多种增殖性疾病或肿瘤中存在TGF-β1表达的异常上升，但TGF-β RⅡ的表达却明显降低甚至缺如［4～6］，提示TGF-β RⅡ是介导TGF-β1发挥正常作用的信号调控因素之一，TGF-β RⅡ表达的下降，可能影响了TGF-β1的上皮细胞生长抑制功能的正常发挥，甚至促进了肿瘤的形成。本组的研究结果也显示，在CA皮损中TGF-β RⅡ的表达是明显下降的，与正常人对照组相比，差异有统计学意义。我们认为，HPV感染引起角质形成细胞表面TGF-β RⅡ表达的下降，使得病毒感染细胞对TGF-β1的敏感性降低，从而影响了TGF-β1的正常诱导和启动，使其抑制上皮增殖的功能不能有效发挥，病毒感染细胞呈现过度增殖，导致了CA疣体的形成和发展。
【参考文献】
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作者单位：中山大学附属第二医院，广东 广州 510120； 南方医科大学附属顺德第一人民医院皮肤科，广东 佛山 528300.