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【摘要】 目的 提取14种蔬菜中凝集素,并分析其部分生物学活性。 方法 以新鲜蔬菜的叶、茎、种子等为材料，经硫酸铵沉淀、透析，得到蛋白质提取液，用不同类型的红细胞检测凝集活性（人的A型、B型、AB型、O型血，兔血、鸡血、蛤蟆血）。通过耐热、耐酸碱、糖抑制、金属离子依赖性实验和抑菌实验比较凝集素的生物活性。 结果 不同种类的蔬菜中凝集素活性各不相同，葱的凝集活性最强,各类凝集素最适环境为偏碱性,对革兰氏阴性菌抑制效果较强。 结论 研究结果为开发凝集素新来源提供基础资料，也为凝集素的分子生物学研究奠定基础。
【关键词】 蔬菜；凝集素；糖抑制；稳定性；抑菌作用
凝集素（Lectin）是指一类从各种植物、无脊椎动物、高等动物和微生物中提纯的糖蛋白或结合糖蛋白，因其能凝集红细胞（含血型物质），故名凝集素。由于凝集素的独特生化性质，作为科研工具的广泛应用，以及在医药方面的诱人前景，近十几年来，凝集素的研究十分兴旺［1］。
植物凝集素方面的研究一直是凝集素研究中的热点。植物凝集素作为一种重要的天然产物，种类繁多，随着对其理化性质、生物活性作用及作用机制的深入研究，将会为生物学、医学、农业研究提供新的研究手段和技术。目前已经发现的植物凝集素近1 000种，广泛分布于豆科、茄科、大戟科、禾本科、百合科和石蒜科等众多植物类群中，通过分离鉴定，对它们的性质、分子结构及功能作了大量的研究，许多工作已深入到基因水平［2,3］。发掘新的植物凝集素，探索其利用的新途径，已成为国内外生物技术工作者新的竞争焦点。
本研究以东北地区常见的14种蔬菜为材料，对其进行蛋白提取，并检测凝集活性，同时进行凝集活力的热稳定性、pH值影响、糖抑制、金属离子依赖性及抑菌实验。
1 材料和方法
1.1 材料 油菜(B.campesris L.)、大头菜(B.oleraceal.var.Capitata L.)、葱(A.ledebourianum Roem.et Schult)、蒜(A.sativum L.)、大白菜(B.pekinesis(Lour)Rupr)、萝卜(R.sativus L.)、生菜(L.sativa L.)、扁豆(D.lablab L.)、韭菜(A.tuberosum)、菠菜(S.oleracea L.)、香菜(C.sativum L.)、芹菜(A.graveolens L.)、马铃薯(S.tuberosum L.)、青椒(C.annuum L.)均购自于齐齐哈尔浏园市场;大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、酿酒酵母菌（Saccharomyces cererisiae）、黑曲霉（Aspergillus niger）由齐齐哈尔大学微生物教研室保存;人的A型、B型、O型、AB型血由齐齐哈尔大学校医院提供，鸡血、蛤蟆血、兔血为自制; 硫酸铵，聚乙二醇2000，乳糖，D-果糖，D-葡萄糖，蔗糖，阿拉伯糖，麦芽糖，无水碳酸钠，柠檬酸三钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，乙二胺四乙酸二钠，牛肉浸膏，蛋白胨，尿素，各种无机盐，牛血清白蛋白均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 蔬菜凝集素的分离和提取 蔬菜洗净、晾干后，马铃薯取块茎为材料，豆角取豆荚为材料，其它取叶片为材料，各取50g剪切后按1﹕2（w/v）加入0.9%生理盐水，用组织捣碎机匀浆。4℃ 5 000rpm离心20min，取上清液。加入硫酸铵达到60%饱和度，4℃过夜。 4℃，5000rpm离心30min后收集沉淀，用PBS（pH7.40）溶解，4 000rpm离心10min除去硫酸铵中的不溶物，取上清液在PBS中透析过夜，之后继续在蒸馏水中透析2～4hr，置于聚乙二醇中吸水浓缩，得到粗品溶液。采用Folin-酚试剂法［4］测蛋白浓度，以牛血清白蛋白作对照。
1.2.2 2%血细胞样品的制备 取人的A型、B型、AB型、O型血及家兔、鸡、蛤蟆等7种新鲜血,以9：1的量加入3.8%的柠檬酸钠，用0.9%的生理盐水反复洗涤2～3次，每次2 000rpm，5min，弃去上清液，配成2%（v/v）的血细胞悬浮液。
1.2.3 血细胞凝集实验 在96孔“V”型血凝板中加入25μl PBS（pH7.4），取凝集素样品25μl，加入第一孔，混匀后取25μl，加入第二孔依次进行系列倍比稀释；将血凝板置于摇床上5min，每孔加入25μl 2%血细胞悬液，室温放置2hr后观察，肉眼观察与显微镜检测相结合判断结果，凡是样品稀释度最高而有显著凝集现象的孔的稀释倍数，判定为该样品的凝集效价。记录为2n，n 为血凝板上该样品产生凝集现象的最大稀释倍数。以PBS作空白对照。
1.2.4 微生物细胞凝集实验 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、产气肠杆菌和枯草芽孢杆菌用牛肉膏蛋白胨培养基活化4～5代后，以无菌生理盐水从斜面上轻轻刮洗菌苔，分别收集到内盛100ml无菌生理盐水的小三角瓶中，用玻璃珠打散，配成终浓度约为108CFU/ml的菌悬液，酿酒酵母菌和黑曲霉用马铃薯培养基活化2～3代后配成107CFU/mL菌悬液。在96孔V型血凝板上加20μl凝集素溶液，与等量磷酸盐缓冲液（PBS）倍比稀释后，加入等体积的菌悬液，振匀。室温下放置1hr后用显微镜（高倍镜）进行检测。凝集活力以产生凝集现象的凝集素最大稀释倍数（以2n表示），以PBS作空白对照。
1.2.5 凝集素热稳定性的测定 在96孔V型血凝板上加45μl凝集素溶液与等量PBS缓冲液倍比稀释后，放在温度为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水浴中保温5min后取出，待其冷却至室温，加入等量的2%兔血细胞悬液，振匀。室温下放置1hr后，用显微镜进行检测。血凝活力以凝集素最大稀释倍数（以2n表示），以PBS作空白对照。比较凝集活性。
1.2.6 pH值对凝集素的凝集活力的影响实验 使用梯度pH缓冲液：pH2.6～7.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；pH7.38～8.34磷酸氢二钠-磷酸氢二钾缓冲液；pH8.6～10.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。在96孔V型血凝板上加45μl凝集素溶液与等体积的缓冲液进行倍比稀释后，加入等体积的2%的红细胞悬液，振匀。室温下放置1hr后用显微镜进行检测。血凝活力以凝集素最大稀释倍数（2n）表示，以缓冲液作空白对照。
1.2.7 糖抑制实验 实验用6种糖分别为乳糖（Lactose）、D-果糖（D-Fructose）、D-葡萄糖（D-Glucose）、蔗糖（Sucrose）、阿拉伯糖（Arabinose）、麦芽糖（Maltose），浓度均为2.5mg/ml。向V型血凝板中加入25μl的凝集素提取液，用等体积的PBS进行倍比稀释，然后每孔中加入25μl糖溶液，放置10min，再加入50μl 2%兔血细胞悬液，振匀。室温下放置1hr后，用显微镜进行检测。血凝活力以产生凝集现象的凝集素最大稀释倍数（2n）表示，以糖液作空白对照。
1.2.8 金属离子对凝集素的凝集活力的研究 取45μl样品置于“V”型血凝板中并加入20mmol/L的EDTA，用2%（v/v）兔血细胞测定其凝集活力，对照样不加EDTA。对于受EDTA抑制的凝集素重新加入10mmol/L金属离子（Fe3+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、K+）溶液后，观察是否恢复凝集活性。
1.2.9 凝集素的抑菌实验 把活化后的菌株用无菌生理盐水洗出并用无菌生理盐水稀释至浓度为106CFU/ml。涂布平板。取含10μl（浓度为6.25mg/ml）凝集素样品的滤纸片放在上述各种含菌的平皿上，每只平皿上间隔一定距离放5片，中间的滤纸片点生理盐水作为阴性对照。然后将各平皿放入每种菌适宜的温度培养箱内培养（细菌37℃培养24hr，酵母菌28℃培养24hr）。观察是否出现透明圈。
2 结果
2.1 14种蔬菜的血凝集活力 肉眼观察，无凝集现象的红细胞沉积在V型板呈大红点，而有凝集现象时呈网状且不下沉（见图1）。采用兔、鸡、蟾蜍、和人的A、B、AB、O型等7种血细胞分别对14种蔬菜进行凝集活性检测。见表1。
图1 蔬菜对兔血细胞的凝集结果（略）
Fig 1 Results of agglutination of extract form sweet patato with rabbit cell
14种蔬菜粗蛋白对7种血细胞的凝集并不具有细胞专一性，生菜、豆荚中不含凝集素，其余12种样品对兔血细胞均有凝集作用；而大头菜、大白菜、青椒、蒜对人血细胞无凝集作用；其他如韭菜、马铃薯等8种蔬菜中提取的凝集素对人血细胞有凝集作用，但无血型专一性。根据这8种凝集素对兔血细胞凝集效价的大小比较得出，凝集活性由强到弱依次为：葱凝集素（0.2775μg/ml）>菠菜凝集素（0.3853μg/ml）>韭菜凝集素（0.4366μg/ml）>油菜凝集素（0.54375μg/ml）>马铃薯凝集素（0.6299μg/ml）>萝卜凝集素（2.049μg/ml）>香菜凝集素（2.1548μg/ml）>芹菜凝集素（6.6345μg/ml）。
表1 蔬菜凝集素对不同血细胞凝集活力的检测（略）
Tab 1 The detection of agglutination activities of different plant lectins
2.2 蔬菜凝集素的热稳定性分析 几种蔬菜凝集素的热稳定性分析结果显示（见表2），各种凝集素均能耐50℃高温，除葱外皆能耐受4℃的低温，60℃热处理以后，菠菜、芹菜、香菜失去凝集活性，而韭菜、马铃薯在70℃仍有凝集活性。可见，韭菜、马铃薯中凝集素具有较高的热稳定性，其中马铃薯凝集素的热稳定性最高。
表2 不同温度对凝集活力的影响（略）
Tab 2 Heat stability of agglutination activities
2.3 pH值对蔬菜凝集素凝集活力的影响 8种蔬菜凝集素在pH=4.0～10.0范围内活力变动情况(见表3)。韭菜在pH≥7.0活性逐渐降低，菠菜在pH6.0～8.6之间具有凝集活性，萝卜在pH6.0～9.0之间具有凝集活性，油菜在pH8.34～9.0之间具有凝集活性，葱在pH4.0～9.6之间具有凝集活性，香菜在pH4.0～7.38之间具有凝集活性，马铃薯在pH4.0～10.0之间具有凝集活性。凝集素活力普遍集中在pH在7.0-8.6之间。相对而言，韭菜、香菜，马铃薯凝集活力表现出对pH值的较广泛适应性。
表3 pH值对蔬菜凝集素凝集活力的影响（略）
Tab 3 The influence of pH on agglutination activities
2.4 蔬菜凝集素的糖抑制作用 用6种糖对蔬菜凝集素进行抑制实验，结果显示韭菜可被乳糖抑制，香菜可被D-果糖抑制，芹菜、马铃薯、葱、油菜、萝卜叶则没有被这六种糖抑制。
2.5 EDTA及金属离子对蔬菜凝集素活力的影响 20mmol/L EDTA对各种蔬菜中的凝集素活性有不同程度的抑制作用（见表4）。韭菜、香菜、葱、马铃薯、萝卜、芹菜中的凝集素不受金属离子螯合剂EDTA的影响，说明这些凝集素的活性中心没有能与EDTA紧密结合的金属离子。菠菜和油菜中的凝集素在这种螯合剂的作用下，其活力受到完全抑制作用。油菜在加入20mmol/L K+后恢复了凝集活性，菠菜在加入20mmol/L Mn2+后恢复了凝集活性。说明这两种凝集素分别需要金属离子K+、Mn2+维持其活性。
2.6 凝集素对微生物的凝集实验 实验检测的具有血细胞凝集活力的8种蔬菜中的凝集素对实验中的微生物均没有凝集作用。
2.7 蔬菜中粗蛋白的抑菌实验 从平板中的透明圈可以看出，韭菜、香菜中的凝集素对产气杆菌有抑制作用，葱、韭菜、香菜、马铃薯中的凝集素对大肠杆菌有抑制作用。葱、韭菜、香菜、马铃薯中的凝集素对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌没有抑制作用。香菜、马铃薯中的凝集素对酵母的生长有微弱抑制作用。测得的各透明圈的直径见表4。
表4 蔬菜粗蛋白抑菌能力比较（略）
Tab 4 The Bacteriostasis activities of lectins
3 讨论
14种蔬菜中提取液与7种血细胞的凝集反应有着较大的差异，说明凝集素在不同植物中的分布和含量存在很大的不同。这14种蔬菜中，马铃薯属于茄科，茄属，能凝集全部7种血细胞，具有很强的凝集能力。青椒属于茄科辣椒属，只能凝集兔血细胞，而且凝集活性较弱。油菜、大头菜、大白菜都属于十字花科，芸苔属，凝集作用同样相差很大，除油菜外只对兔血细胞有凝集作用。同样，葱、蒜、韭菜都属于百合科，葱属，对血细胞的凝集作用也不一样，但其凝集程度普遍要比十字花科强。以上现象说明，蔬菜凝集素的存在及活力并无种属特异性。很多文献报道豆科植物中含有大量的凝集素［5,6］，本实验利用新鲜的豆荚进行实验，发现从豆荚中提取的蛋白对血细胞没有凝集作用，说明凝集素在同一植物不同组织中的分布存在差异。
不同品种的蔬菜中凝集素的活性不同，可能是由于其凝集素的含量不同，也可能是由于其含有的凝集素种类、性质不同。在农业生产中，应该尽量淘汰所含凝集素活性高的品种，筛选培育并扩大种植活性低的品种，以减少对人体健康的影响。对所含凝集素活性高的品种，亦可用以分离制取高纯度的凝集素产品，适应医疗、科研及工农业等领域对其的迫切需要。
本实验中马铃薯、韭菜的凝集素耐热性更强。有研究报道从韭菜的叶片组织分离出的凝集素具有一定的热稳定性，对碱处理较对酸处理稳定，氨基酸组成分析表明该凝集素含有14种氨基酸，其中半胱氨酸含量较高［7,8］。马铃薯凝集素的耐热、耐碱性质与李延清等的报道完全一致［9］，可能因为其活性位点位于糖分子上［10,11］。但是，这种耐热性的差异究竟是由于植物生长环境造成还是与其活性位点的化学性质相关，还有待于对其分子结构作进一步研究方能确定。本研究还发现各种蔬菜凝集素都有其最适凝集温度和凝集pH，除马铃薯外，都在20～30℃之间表现出最大凝集活性，这与植物生长期环境的平均温度相一致。所选择的蔬菜都是陆生植物，黑龙江土壤偏碱性，研究发现凝集素的最适凝集pH偏碱性，这与其生活环境的酸碱度一致。
凝集素能与细胞表面的糖相结合从而使血细胞凝集，对其产生抑制作用的糖被认为结构互补于凝集素结合部位。韭菜具有与互补的乳糖专一结合的位点；香菜具有与D-果糖专一结合的位点；至于芹菜、马铃薯、葱、油菜、萝卜叶提取液均不被供试的6种糖抑制，并不排除这些提取液含有不同糖结合类型的凝集素，还需要进一步的实验证实。
植物凝集素在植物界的分布极其广泛，探索、开发植物凝集素的独特的生理功能，如植物防御( 抗虫、真菌、细菌及病毒)、与固氮菌共生识别等作用在农业生产中意义重大［3］。本研究初步分析了蔬菜凝集素对细菌、真菌的凝集和抑菌作用。但检测的8种蔬菜中的凝集素对实验微生物均没有凝集作用。通常细菌、酵母菌细胞外壁都富含蛋白、多糖、水组成的粘液层，很容易与介质发生黏附作用，可能由于空间效应，供试的微生物细胞表面的糖基无法和凝集素结合位点发生互补接触，或者由于所使用的凝集素未经提纯，多种混杂蛋白的存在削弱或消除了凝集素与微生物细胞表面的作用，致使二者无法发生凝集反应。
多种报道表明一些凝集素具有抑制微生物生长的能力［12,13］，检测的蔬菜粗蛋白对大肠杆菌、产气肠杆菌这些革兰氏阴性菌有抑制作用。革兰氏阳性细菌的细胞壁中有40%～90%的肽聚糖层，构成致密的网状结构，阻止了外源大分子物质的进入，从而也削弱了外源物质的有效杀菌作用，因此，供试凝集素对枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌并未表现出生长抑制作用。
凝集素的功能与其分子结构密不可分，未来的实验中我们将着重探索分离、纯化韭菜、菠菜、葱这3种蔬菜中凝集素的有效方法，解析其分子结构，研究开发蔬菜凝集素的多种生理功能。对充分有效利用植物资源以及从天然产物中开发生物活性物质具有重要意义。
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作者单位：上海市临床检验中心,上海 200126； 齐齐哈尔大学生命科学与工程学院, 黑龙江 齐齐哈尔 161000； 上海邦成生物科技有限公司,上海 200237.