梅毒螺旋体检测的实验研究进展

【摘要】  梅毒是一种危害严重的性传染病，对梅毒进行准确的检测，可临床确诊梅毒以及防止梅毒的传播。根据梅毒螺旋体的生物学特性及病情的分期，梅毒螺旋体的实验室检测主要包括：病原体、非特异性抗体、特异性抗体及基因的检测。本文对当前梅毒螺旋体的检测状况作一综述。

【关键词】  梅毒 病原体 抗体 基因

梅毒(Syphilis)是一种性传播疾病，其病原体是梅毒螺旋体(Treponema pallidum，TP)，近年来在我国的发病率呈逐年增加的趋势。检测梅毒螺旋体的方法很多，直接观察梅毒螺旋体，可准确诊断梅毒。人体感染梅毒螺旋体后，可产生多种抗体，主要有IgM、IgG类两种特异性抗螺旋体抗体；另一类非特异性抗体又称反应素，是由螺旋体破坏的组织细胞所释放的类脂样物质以及螺旋体自身的类脂和脂蛋白刺激机体产生的IgM、IgG类抗体；这些可通过梅毒的血清学试验进行梅毒的辅助诊断。而基因诊断技术检测梅毒则是具有很高敏感性和特异性的先进方法。对于临床输血的血液样本，采用准确、灵敏及简便的梅毒检测方法是至关重要的。

　　1  梅毒病原体的检测
   
　　采用病变组织中的分泌物直接进行梅毒螺旋体的观察，如找到运动活泼的苍白螺旋体可直接诊断梅毒，是最特异、最准确的诊断方法；但其假阴性率很高，主要是因为相对落后的标本收集和判读方法，且一些实验需要特殊的仪器。目前临床检测的方法有：①暗视野显微镜检查梅毒螺旋体(DF)：用暗视野显微镜可直接观察到病灶分泌物中的梅毒螺旋体。对一期和二期梅毒的皮肤黏膜损害利淋巴结病变具有快速、简便和可靠的诊断价值，是性病实验室常用的方法［1,2］，但由于要求严格的技术和敏感性较低而限制其应用。并非所有梅毒的病期中都能找到梅毒螺旋体，如果阴性，也不能完全排除梅毒。②活体组织检查梅毒螺旋体：常用银染色法(Warthinstarry)或荧光抗体染色，用病灶组织中的分泌物进行涂片染色，于普通显微镜或荧光显微镜下可查见梅毒螺旋体，呈黑褐色。银染色的阳性结果需要谨慎解释，因为类似梅毒螺旋体的其他物质易混淆。③多功能显微诊断仪(Multifunctional microsoopy diagnostic instrument，MDI)：是近年来国外开发的一种综合相差对比、暗视野及偏振光的可变投影显微镜,其特点是待检标本不需染色及任何加工处理，而是将“活的”真实的样本直接进行观察，具有直接、方便、快速的优点，特别是在梅毒一期的诊断中有很好的临床价值［3］。但整套仪器价格昂贵，很难普及到每个梅毒检测实验室。

　　2  梅毒非特异性抗体试验
   
　　用心拟脂作抗原，测定血清中抗心磷脂抗体，此类试验为非特异性抗体检测试验;早期检测梅毒采用的康、瓦氏试验因操作复杂、假阳性太高，这两种试验现已被淘汰。其它非特异性抗体检测试验，因操作简便，目前多数医院列为梅毒的常规筛查试验;这类试验可观察疗效、复发及再感染，适于二期梅毒的诊断，而不适于诊断一、三期梅毒，包括潜伏梅毒、神经梅毒的诊断。该类试验的假阳性多发生在肿瘤、自身免疫性疾病、EB病毒感染、肝炎等患者［4］。①性病研究实验室试验(Venereal disease research laboratory test， VDRL)：美国Pangborn等发现一种性病研究实验室抗原(VDRL)，是从牛心肌中提取的心磷脂，适量加入胆固醇及卵磷脂以提高敏感性，通常称这种抗原为心磷脂抗原。VDRL试验属于微量玻片法，是唯一推荐用于检测脑脊液反应素的试验，对诊断神经梅毒具有重要价值，可作定量及定性试验，操作简单，试剂及对照血清已标准化，费用低。但对一期梅毒敏感性不高。②不加热血清反应素试验(USR)：是VDRL抗原的改良，本方法在我国目前广泛采用，特别血清不需加热灭活,节省操作时间；但主观性强，易出现漏检。USR试验可作为疗效观察或随访是否复发或再感染的指征。③甲苯胺红不加热血清反应素试验(TRUST)：TRUST试验所用的抗原是从牛心提取的心磷脂和从鸡蛋黄提取的卵磷脂及胆固醇，试验结果清晰易读，简便快速，稳定性好［5］，缺点是许多因素影响结果，如高脂血症和抗心磷脂抗体阳性的血清均可干扰而出现假阳性结果［6］。④快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)：是80年代问世的非特异性梅毒血清学试验，所用抗原为标准的牛心肌脂抗原,该方法操作简便、迅速，适用于大量标本检测，目前许多血站用RPR试验对献血者进行梅毒普查。 RPR试验和DF方法对一期梅毒的诊断相互配合，可早期诊断梅毒［1］；同时，RPR试验也可作为疗效观察或随访是否复发或再感染的指标。缺点是当抗体含量过高时，易出现假阴性，即前带现象(Prozonr phenomenon)，还易出现生物学假阳性反应。对潜伏期梅毒、神经梅毒不敏感。

　　3  梅毒螺旋体特异性抗体试验
   
　　用活的或死的梅毒螺旋体或它的某些特异肽段来作抗原测定抗螺旋体抗体。这种试验敏感性和特异性均高，一般用作确认试验［7］。这种试验是检测血清中抗梅毒螺旋体IgG或IgM抗体，该抗体即使患者经过足够治疗，仍能长期存在，甚至终身不消失，血清反应持续存在阳性，因此，不能用于观察疗效。但作为病人输血前对血样本安全的要求，其梅毒的检测试验是必要的。其试验有：①荧光密螺旋体抗体吸收试验 (Fluorescent trponemal antibody absorption test，FTA-ABS)：是以Reiter株抗原吸收待检血清，保证了试验结果的特异性；以整条梅毒螺旋体检测血清中抗体，提高了试验的敏感性。文献报道FTA-ABS对各期梅毒检测的特异性达到92％［3］。它的主要缺点是需荧光显微镜设备，当标本荧光微弱病情可疑时，试验结果判定常带有主观色彩。②梅毒螺旋体血球凝集试验(Treponema pallidum hemagglutination assay，TPHA)：是用生物细胞(火鸡或羊红细胞)做抗原载体，吸附从兔睾丸中提取的粗制梅毒螺旋体粉碎物抗原，检测血清中特异性梅毒螺旋体抗体，是目前国内许多医院常用的梅毒血清确认试验。试剂制备过程排除了各种非特异性反应，因此，TPHA的敏感性和特异性较高。缺点是试剂成本较高，操作较麻烦，且易发生自凝现象和生物学假阳性［9］。③梅毒螺旋体明胶凝集试验(Trponema pallidum particle agglutination，TPPA)：TPPA与 TPHA操作原理基本相同，只不过是用明胶颗粒作为抗原载体，检测血清中特异性梅毒螺旋体抗体的试验。TPPA作为梅毒抗体检测的确证方法，有着很高的敏感度和特异性，操作较简便，结果清晰易判断，但价格昂贵，且结果判断难以自动化。④梅毒螺旋体免疫印迹试验(Western immunoblottlng technique)：是80年代发展起来的一种检测技术，它结合了免疫学和分子生物学的特点，敏感性高，特异性强［10,11］。Dettori等［12］认为免疫印迹法用于梅毒诊断优于FTA-ABS和TPHA方法，对二期梅毒或早期潜伏梅毒、神经梅毒的阳性率均为100％，对于非螺旋体标本(包括正常标本、生物学假阳性标本以及γ球蛋白增高或抗核抗体的标本)检测没有假阳性或可疑反应。免疫印迹法操作简便，不要求试验仪器和环境，结果容易判定，但成本较高。⑤梅毒金标记试验(Gold-Iabeled)：金标记结合了ELISA与层析法的优点，以基因工程方法生产的重组梅毒螺旋体外膜蛋白为包被和标记抗原，采用胶体金标记和免疫层析技术，检材可以是血清、血浆、全血，具有快速、简便、灵敏度高、特异性强及无需仪器设备之特点［13］。灵敏度、特异性与TPPA相比无显著差异，比RPR、 TRUST好［14］。但金标记试验进行实验室质控还存在困难，标准方面还难以形成统一。⑥梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验(Enxyme-1inked immunosorbent assay，TP-ELISA)：TP-ELISA是近年来应用TP基因工程研制成功而建立的方法，灵敏度、特异度较高［15］，是用双抗原夹心法测定梅毒特异性抗体。TP-ELISA方法主要检测梅毒螺旋体IgG和IgM抗体，TP-ELISA方法对一期梅毒的诊断率较高，检测操作简便,不受样本纤维蛋白和溶血等影响，一次可进行多份样本的检测。因此,TP-ELISA方法被公认为梅毒血清学实验诊断的首选方法［16］。

　　4  梅毒螺旋体基因诊断试验
   
　　梅毒螺旋体基因诊断试验(TP-PCR)检测梅毒螺旋体DNA，特异性很强、敏感性很高，是目前诊断梅毒螺旋体的先进方法。PCR法诊断一期梅毒的灵敏度最高［17］，这是因为人体感染梅毒要4～10周才可产生一定数量的抗体，而特异性抗体比非特异性抗体早1周出现。PCR检测梅毒螺旋体的DNA，其敏感性、特异性均优于血清学方法［18］。由于梅毒基因有多个分型，即使采用常规的PCR方法检测梅毒也都可能出现一定的假阴性，目前采用巢式PCR方法可提高对梅毒的检出率，其原理是依Pillay等［19,20］根据arp和tpr基因的差异，创建了梅毒螺旋体基因分型方法并应用于分子流行病学研究。Pillay梅毒基因分型方法是根据梅毒螺旋体间存在着arp和tpr基因序列的差异，arp基因编码蛋白位于细胞膜或分泌到细胞外，其包含60bp的重复序列，不同的菌枝含有的arp重复序列个数不同;由于arp基因的扩增片段长度为1 000bp左右，扩增条件和合酶要求较高，致使单一PCR扩增的敏感性较低。文献报道用半巢式PCR法扩增arp，结果检出率为87．1％。而tpr基因分型是通过扩增tpr基因族的tprE、G和J基因，在梅毒螺旋体基因组中存在多个拷贝，经Mse I酶切后显示不同的内切酶图谱，采用原创巢式PCR方法扩增阳性率较高，因此，建立对梅毒螺旋体高度特异的 PCR方法是很重要的。

　　5  结语
   
　　梅毒是危害性极大的传染病，对于临床输血的血液样本，为了确保其安全，必须准确地检测梅毒，因此选择一种敏感性和特异性均高的检测方法是至关重要的。目前，国内实验室采用直接检测梅毒病原体方法的不多，多数用实验简单、成本低廉的梅毒非特异性试验(如RPR法、TRUST法)进行梅毒的常规筛选及疗效观察、判断复发或再感染，用梅毒特异性试验(如FTA-ABS、TPPA或ELISA法)进行确认试验，用于诊断各期梅毒。而特别对于输血的安全来说，除了采用上述的两类方法外，如果检测结果显示可疑，则采用特异性强、敏感性高的基因诊断技术来确认是非常必要的。梅毒检测的实验室技术发展很快，如美国Mirkin近年发展了一种生物芯片技术对梅毒进行快速、准确、简便的诊断研究。这些新的实验方法需要我们今后不断的总结。

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作者单位：湛江中心人民医院临床检验中心,广东 湛江 524037; 新疆农业大学医院,新疆 乌鲁木齐 830052