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【摘要】 抗原特异性细胞毒性T细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL）是特异性细胞免疫应答的主要效应细胞，在机体控制病毒感染及清除病毒过程中起主导作用，其水平和功能与病毒的转归及抗病毒疗效密切相关。近年来抗原特异性CTL在病毒感染性疾病中的作用已成为研究的热点。
【关键词】 细胞毒性T细胞 病毒感染 抗原
抗原特异性细胞毒性T细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL）是特异性细胞免疫应答的主要效应细胞，在机体控制病毒感染及清除病毒过程中起主导作用。CTL主要来源于胸腺，以CTL前体（CTLp）形式存在，此类细胞可识别抗原，但无杀伤靶细胞的功能。CTLp通过其表面抗原特异性受体（TCR）识别并结合感染细胞表面的MHC-I类分子多肽复合物，特异性活化增殖成为CTL，并获得细胞毒性和产生细胞因子等效应功能。抗原特异性CTL的定量或定性检测无论对临床诊断、疫苗免疫或过继治疗后的评估都是至关重要的手段。对抗原特异性CTL的研究已成为近年来的研究热点。本文就抗原特异性CTL的作用机制及其在病毒感染性疾病中的作用作一综述。
1 特异性CTL的作用机制
1.1 共刺激分子 CTL的活化需要两个不同的信号。一是TCR-CD3复合物与MHC-I类分子提呈抗原肽结合提供的，二是抗原提呈细胞（APC）提供的共刺激信号。近年研究发现多种共刺激分子，根据氨基酸序列的同源性，分为二类。第一类称为CD28家族，包括CD28、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen，CTLA-4)，可诱导协同刺激分子(Inducible costimulatory molecule，ICOS)、程序性死亡蛋白1(Programmed death protein-1，PD-1)。第二类称为肿瘤坏死因子(TNF)受体家族，包括4-1BB、CD27、CD30、CD40、OX40等。
1.1.1 CD28／CTLA-4 CD28与B7(B7-l，B7-2)结合后介导的协同刺激信号在初始CTL的活化过程中最具特征性意义。CD28与B7(B7-l，B7-2)结合能增强细胞因子IL-2基因转录，促进CTL细胞增殖，且维持了转录活性平衡，减少CTL凋亡，在初始CTL细胞传递活化信号中有重要作用；而抑制性受体CTLA-4能竞争性与B7结合，抑制了细胞周期进程，引起CTL免疫耐受。Mellor等［1］研究表明，CTLA-4与B7结合后通过反向传导抑制性信号引起DC细胞内的吲哚2，3-双加氧酶活化，使得游离的色氨酸数量减少，从而导致T细胞活性降低。
1.1.2 PD-1 PD-1是CD28家族继CTLA-4之后发现的第二个抑制性受体,最新研究认为PD-1及其配体PD-L的信号途径与病毒感染关系密切,该靶位极具治疗前景［2］。低水平的PD-1表达就能有效抑制早期激活的T细胞,抑制T细胞抗原受体(TCR)的信号。PD-1除了能抑制糖代谢，还能通过阻断CD28介导激活的PI3K途径使得Akt激活。Latchman等［3］发现在特异性抗原免疫PD-L1 缺失的小鼠体内,PD-L1的缺乏能促进CTL细胞的增殖,且CTL的特异性杀伤功能得到增强。
1.1.3 4-1BB Wilcox等［4］发现体内4-1BB受体的配基化能阻止CD8+CTL无能，甚至能使无能CTL重新获得活性。他们在3种分别由可溶性抗原、肿瘤抗原及异体抗原引起CD8+CTL无能的动物模型中观察到，4-1BB均能诱导无能的CTL活化，表现为CTL的重新增殖、功能恢复和分泌细胞因子。另外4-1BB对记忆性和效应性CTL也有重要作用，可以延长其生存时间，促使CTL产生细胞因子IL-2和IFN-γ,而且还能增强CTL的功能，延长免疫效应时间。
1.1.4 CD27 CD27及其配体CD70作为第二信号可以促进T细胞的增殖，调节CTL的数量和功能。CD27的激活提高了T细胞受体(TCR)的表达，并使具有细胞溶解作用和分泌IFN-γ能力的效应CTL生成增加 。Croft［5］认为CD27与TNF家族的其他成员如OX40(CD134)、4-1BB(CD137)对许多T细胞反应的影响具有同等作用，这些分子控制着效应性T细胞的数量和记忆性T细胞的进一步发展。在体内体外试验中重组可溶性CD70刺激CTL细胞反应时,显示CD27/CD70系统可增加效应性和记忆性细胞池的数量［6］。
1.2 CTL的表型 基于不同细胞表面分子，如CD45RA/RO、共刺激受体CD28/CD27以及趋化因子受体CCR7等，研究者们将T淋巴细胞区分为不同分化表型的细胞亚群。主要为初始性、效应性及记忆性CTL三型。每型分别代表了不同的分化状态，各具不同的效应功能。深入研究后还发现，CD8+CD27-和CD8+CD28-表型的细胞中不仅包含效应细胞，而且还有记忆细胞。联合CD45RA、CCR7、CD62L等分子，记忆细胞还可以进一步细化为中心记忆细胞和效应记忆细胞［7］。随着表型的细化，各个不同功能的亚群也可被分离开来，如初始T细胞(CD45RA+CD27+CD28+CCR7+)、效应T细胞(CD45RA+CD27-CD28-CCR7-)和记忆T细胞(CD45RO+CD27+/-CD28-/+CCR7-/+)。有一群老化细胞也具有CD8+CD28-的分化表型［8］，CD28的缺失表达是这群细胞的特征性标志。与效应细胞正好相反，老化细胞增殖能力弱、细胞毒效应缺失，抗凋亡能力下降，在老年人和慢性感染性疾病患者等机体免疫力低下的人群体内老化细胞会增加。
1.3 CTL的杀伤途径 CTL可通过细胞毒途径和非溶胞途径发挥其免疫效应。细胞毒途径是指特异性CTL通过分泌穿孔素、颗粒酶及其表面表达的Fas配体等介质摧毁感染病毒的靶细胞。在这条途径中特异性CTL在清除病毒的同时也将导致靶细胞的裂解。非溶胞途径是指机体针对病毒编码产物所产生的特异性CTL,通过分泌特定的细胞因子抑制HBV的复制继而达到清除病毒的作用。这条途径中特异性T淋巴细胞只是清除了靶细胞内的病毒，而对靶细胞本身并无损伤。在病毒的急性感染过程中，两条途径均发挥重要作用，但在病毒持续感染过程中，特异性CTL功能状态如何，以何种途径为主发挥效应，目前仍不明确。Guidotti等［9］研究认为在乙肝病毒感染中非细胞裂解机制更为重要。Guidotti等给HBV转基因小鼠过继输入特异性CTL后发现，小鼠肝脏和血清中的HBV DNA和HBcAg得以清除，而未引起广泛的肝细胞死亡（仅不到1%的肝细胞遭受破坏）。根据血清学研究结果估计：大约只有10％的肝细胞可直接经CTL的胞毒途径而被裂解。当将穿孔素被敲除的HBV特异性CTL过继免疫后，不能诱导出小鼠肝炎表现，却能观察到清除病毒RNA转录产物的效应，提示非细胞裂解机制发挥主要作用。
2 特异性CTL在病毒感染性疾病中的作用
2.1 HIV感染 大量研究表明，病毒特异性CTL反应是机体对抗人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的主要机制。CTL在HIV感染中与病毒载量呈负相关，在长期无症状进展者体内存在活跃的CTL反应。Altman等［10］在大量无症状AIDS患者体内检测到抗原特异性CTL，其百分率高达2%，且其标志的阳性率与CTL的杀伤功能密切相关，细胞表型以记忆及效应细胞占优势。另外，CTL的增殖水平在HIV感染中与疾病的进展呈负相关。最近3个研究小组分别在HIV感染者的CD8+CTL细胞中发现PD-1表达明显上调,与HIV 特异性的CTL细胞的功能衰竭有关,并且其表达与病毒滴度呈正比,与CD4+T细胞数呈反比［11～13］,首次证实PD-1信号与病毒的持续性感染密切相关。随着疾病进展，HIV病毒不断复制使大量抗原提呈细胞及辅助性T细胞遭到破坏，并且损害了HIV特异性CTL正常的功能性分化，以至于不能发挥正常的细胞毒性作用，最终将导致免疫系统的崩溃。
2.2 HBV感染 在HBV感染初期，机体可产生多克隆、强烈的CTL反应，但在感染的慢性期，CTL功能低下，甚至呈无反应状态。Maini等［14］在急性HBV感染患者中观察到，HBVcore18～27特异性CD8+CTL占循环CD8+细胞的1.3%，其水平与血清中ALT的水平呈正相关，细胞表型以效应细胞（CD38+,HLA-DR+,CD62L,CD45RA）占优势，其增殖能力受限，但经同源肽刺激后可表现细胞毒性。随着疾病的恢复，特异性CTL数量下降，以效应细胞为主的细胞表型也随之下降，增殖能力有所恢复。普遍认为，慢性乙肝持续感染的根本原因在于特异性CTL的功能低下。Tsai等［15］对36例分别接受IFN-a、胸腺肽和拉米夫定治疗的慢性乙肝患者研究发现，经治疗3个月后，显效组的外周血特异性CTL数量、靶细胞杀伤能力以及表达IFN-γ的能力显著高于部分显效组和未显效组。张蓓等［16］在慢性乙肝患者体内检测到特异性CTL，但是其产生穿孔素、颗粒酶及IFN-γ的能力是低下甚至缺失的。且慢性乙肝患者特异性CTL表达膜表面共刺激分子CD28下降，50%以上的HBcAg（18-27）及HBeAg（335-343）特异性CTL不表达CD28。研究提示，持续抗原刺激导致丢失CD28表达丢失，最终导致细胞无能。最新研究发现慢性乙肝患者特异性CTL还表达抑制性受体KIR。KIR能够与靶细胞表面的MHC-I类分子结合，传输抑制性信号，抑制T细胞功能，表达KIR能使特异性CTL不能有效杀伤病毒感染细胞［17］。HBV特异性CTL表达KIR与慢性乙肝患者特异性CTL的功能下降，最终导致病毒持续感染。
2.3 HPV感染 既往研究证实在宫颈癌患者外周血、肿瘤组织、局部淋巴结中存在HPV16E7表位特异性CTL。多数宫颈癌前病变的自发消退，CD4+T细胞的浸润，疣体内巨噬细胞的回归，说明CTL在防止HPV感染从上皮内瘤样增生到宫颈癌的发展。Qin［18］等制备HPV16E7肽免疫小鼠后检测到HPV16E7表位特异性CTL反应和T细胞增殖。钱起丰等［19］检测10例尖锐湿疣患者外周血HPV16E711-20特异性CTL时,发现活化型与记忆型CTL比例显著增高。另外，13例健康人外周血单一核细胞体外经HPV16E711-20多肽刺激后，成功诱导了CD8+T细胞克隆增殖，产生特异性CTL。
2.4 其他病毒感染 在巨细胞病毒感染者外周血中能检测到0.3%甚至更高比例的抗原特异性CTL，而在急性EB病毒感染者中，该数值可达40%，但这些急性抗原特异性CTL在机体急剧下调并迅速凋亡，仅代表了短寿命的终末期效应细胞。此外在HCV、流感病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）等病毒感染者体内也检测到一定数量的抗原特异性CTL。Appay等［20］报道，在CMV感染患者体内的抗原特异性CTL存在着一定的功能缺陷，表现为其产生的穿孔素、颗粒酶及IFN-γ降低甚至衰竭。
抗原特异性细胞毒性T细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL）是特异性细胞免疫应答的主要效应细胞，在机体控制病毒感染及清除病毒过程中起主导作用。CTL主要来源于胸腺，以CTL前体（CTLp）形式存在，此类细胞可识别抗原，但无杀伤靶细胞的功能。CTLp通过其表面抗原特异性受体（TCR）识别并结合感染细胞表面的MHC-I类分子多肽复合物，特异性活化增殖成为CTL，并获得细胞毒性和产生细胞因子等效应功能。抗原特异性CTL的定量或定性检测无论对临床诊断、疫苗免疫或过继治疗后的评估都是至关重要的手段。对抗原特异性CTL的研究已成为近年来的研究热点。本文就抗原特异性CTL的作用机制及其在病毒感染性疾病中的作用作一综述。
1 特异性CTL的作用机制
1.1 共刺激分子 CTL的活化需要两个不同的信号。一是TCR-CD3复合物与MHC-I类分子提呈抗原肽结合提供的，二是抗原提呈细胞（APC）提供的共刺激信号。近年研究发现多种共刺激分子，根据氨基酸序列的同源性，分为二类。第一类称为CD28家族，包括CD28、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen，CTLA-4)，可诱导协同刺激分子(Inducible costimulatory molecule，ICOS)、程序性死亡蛋白1(Programmed death protein-1，PD-1)。第二类称为肿瘤坏死因子(TNF)受体家族，包括4-1BB、CD27、CD30、CD40、OX40等。
1.1.1 CD28／CTLA-4 CD28与B7(B7-l，B7-2)结合后介导的协同刺激信号在初始CTL的活化过程中最具特征性意义。CD28与B7(B7-l，B7-2)结合能增强细胞因子IL-2基因转录，促进CTL细胞增殖，且维持了转录活性平衡，减少CTL凋亡，在初始CTL细胞传递活化信号中有重要作用；而抑制性受体CTLA-4能竞争性与B7结合，抑制了细胞周期进程，引起CTL免疫耐受。Mellor等［1］研究表明，CTLA-4与B7结合后通过反向传导抑制性信号引起DC细胞内的吲哚2，3-双加氧酶活化，使得游离的色氨酸数量减少，从而导致T细胞活性降低。
1.1.2 PD-1 PD-1是CD28家族继CTLA-4之后发现的第二个抑制性受体,最新研究认为PD-1及其配体PD-L的信号途径与病毒感染关系密切,该靶位极具治疗前景［2］。低水平的PD-1表达就能有效抑制早期激活的T细胞,抑制T细胞抗原受体(TCR)的信号。PD-1除了能抑制糖代谢，还能通过阻断CD28介导激活的PI3K途径使得Akt激活。Latchman等［3］发现在特异性抗原免疫PD-L1 缺失的小鼠体内,PD-L1的缺乏能促进CTL细胞的增殖,且CTL的特异性杀伤功能得到增强。
1.1.3 4-1BB Wilcox等［4］发现体内4-1BB受体的配基化能阻止CD8+CTL无能，甚至能使无能CTL重新获得活性。他们在3种分别由可溶性抗原、肿瘤抗原及异体抗原引起CD8+CTL无能的动物模型中观察到，4-1BB均能诱导无能的CTL活化，表现为CTL的重新增殖、功能恢复和分泌细胞因子。另外4-1BB对记忆性和效应性CTL也有重要作用，可以延长其生存时间，促使CTL产生细胞因子IL-2和IFN-γ,而且还能增强CTL的功能，延长免疫效应时间。
1.1.4 CD27 CD27及其配体CD70作为第二信号可以促进T细胞的增殖，调节CTL的数量和功能。CD27的激活提高了T细胞受体(TCR)的表达，并使具有细胞溶解作用和分泌IFN-γ能力的效应CTL生成增加 。Croft［5］认为CD27与TNF家族的其他成员如OX40(CD134)、4-1BB(CD137)对许多T细胞反应的影响具有同等作用，这些分子控制着效应性T细胞的数量和记忆性T细胞的进一步发展。在体内体外试验中重组可溶性CD70刺激CTL细胞反应时,显示CD27/CD70系统可增加效应性和记忆性细胞池的数量［6］。
1.2 CTL的表型 基于不同细胞表面分子，如CD45RA/RO、共刺激受体CD28/CD27以及趋化因子受体CCR7等，研究者们将T淋巴细胞区分为不同分化表型的细胞亚群。主要为初始性、效应性及记忆性CTL三型。每型分别代表了不同的分化状态，各具不同的效应功能。深入研究后还发现，CD8+CD27-和CD8+CD28-表型的细胞中不仅包含效应细胞，而且还有记忆细胞。联合CD45RA、CCR7、CD62L等分子，记忆细胞还可以进一步细化为中心记忆细胞和效应记忆细胞［7］。随着表型的细化，各个不同功能的亚群也可被分离开来，如初始T细胞(CD45RA+CD27+CD28+CCR7+)、效应T细胞(CD45RA+CD27-CD28-CCR7-)和记忆T细胞(CD45RO+CD27+/-CD28-/+CCR7-/+)。有一群老化细胞也具有CD8+CD28-的分化表型［8］，CD28的缺失表达是这群细胞的特征性标志。与效应细胞正好相反，老化细胞增殖能力弱、细胞毒效应缺失，抗凋亡能力下降，在老年人和慢性感染性疾病患者等机体免疫力低下的人群体内老化细胞会增加。
1.3 CTL的杀伤途径 CTL可通过细胞毒途径和非溶胞途径发挥其免疫效应。细胞毒途径是指特异性CTL通过分泌穿孔素、颗粒酶及其表面表达的Fas配体等介质摧毁感染病毒的靶细胞。在这条途径中特异性CTL在清除病毒的同时也将导致靶细胞的裂解。非溶胞途径是指机体针对病毒编码产物所产生的特异性CTL,通过分泌特定的细胞因子抑制HBV的复制继而达到清除病毒的作用。这条途径中特异性T淋巴细胞只是清除了靶细胞内的病毒，而对靶细胞本身并无损伤。在病毒的急性感染过程中，两条途径均发挥重要作用，但在病毒持续感染过程中，特异性CTL功能状态如何，以何种途径为主发挥效应，目前仍不明确。Guidotti等［9］研究认为在乙肝病毒感染中非细胞裂解机制更为重要。Guidotti等给HBV转基因小鼠过继输入特异性CTL后发现，小鼠肝脏和血清中的HBV DNA和HBcAg得以清除，而未引起广泛的肝细胞死亡（仅不到1%的肝细胞遭受破坏）。根据血清学研究结果估计：大约只有10％的肝细胞可直接经CTL的胞毒途径而被裂解。当将穿孔素被敲除的HBV特异性CTL过继免疫后，不能诱导出小鼠肝炎表现，却能观察到清除病毒RNA转录产物的效应，提示非细胞裂解机制发挥主要作用。
2 特异性CTL在病毒感染性疾病中的作用
2.1 HIV感染 大量研究表明，病毒特异性CTL反应是机体对抗人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的主要机制。CTL在HIV感染中与病毒载量呈负相关，在长期无症状进展者体内存在活跃的CTL反应。Altman等［10］在大量无症状AIDS患者体内检测到抗原特异性CTL，其百分率高达2%，且其标志的阳性率与CTL的杀伤功能密切相关，细胞表型以记忆及效应细胞占优势。另外，CTL的增殖水平在HIV感染中与疾病的进展呈负相关。最近3个研究小组分别在HIV感染者的CD8+CTL细胞中发现PD-1表达明显上调,与HIV 特异性的CTL细胞的功能衰竭有关,并且其表达与病毒滴度呈正比,与CD4+T细胞数呈反比［11～13］,首次证实PD-1信号与病毒的持续性感染密切相关。随着疾病进展，HIV病毒不断复制使大量抗原提呈细胞及辅助性T细胞遭到破坏，并且损害了HIV特异性CTL正常的功能性分化，以至于不能发挥正常的细胞毒性作用，最终将导致免疫系统的崩溃。
2.2 HBV感染 在HBV感染初期，机体可产生多克隆、强烈的CTL反应，但在感染的慢性期，CTL功能低下，甚至呈无反应状态。Maini等［14］在急性HBV感染患者中观察到，HBVcore18～27特异性CD8+CTL占循环CD8+细胞的1.3%，其水平与血清中ALT的水平呈正相关，细胞表型以效应细胞（CD38+,HLA-DR+,CD62L,CD45RA）占优势，其增殖能力受限，但经同源肽刺激后可表现细胞毒性。随着疾病的恢复，特异性CTL数量下降，以效应细胞为主的细胞表型也随之下降，增殖能力有所恢复。普遍认为，慢性乙肝持续感染的根本原因在于特异性CTL的功能低下。Tsai等［15］对36例分别接受IFN-a、胸腺肽和拉米夫定治疗的慢性乙肝患者研究发现，经治疗3个月后，显效组的外周血特异性CTL数量、靶细胞杀伤能力以及表达IFN-γ的能力显著高于部分显效组和未显效组。张蓓等［16］在慢性乙肝患者体内检测到特异性CTL，但是其产生穿孔素、颗粒酶及IFN-γ的能力是低下甚至缺失的。且慢性乙肝患者特异性CTL表达膜表面共刺激分子CD28下降，50%以上的HBcAg（18-27）及HBeAg（335-343）特异性CTL不表达CD28。研究提示，持续抗原刺激导致丢失CD28表达丢失，最终导致细胞无能。最新研究发现慢性乙肝患者特异性CTL还表达抑制性受体KIR。KIR能够与靶细胞表面的MHC-I类分子结合，传输抑制性信号，抑制T细胞功能，表达KIR能使特异性CTL不能有效杀伤病毒感染细胞［17］。HBV特异性CTL表达KIR与慢性乙肝患者特异性CTL的功能下降，最终导致病毒持续感染。
2.3 HPV感染 既往研究证实在宫颈癌患者外周血、肿瘤组织、局部淋巴结中存在HPV16E7表位特异性CTL。多数宫颈癌前病变的自发消退，CD4+T细胞的浸润，疣体内巨噬细胞的回归，说明CTL在防止HPV感染从上皮内瘤样增生到宫颈癌的发展。Qin［18］等制备HPV16E7肽免疫小鼠后检测到HPV16E7表位特异性CTL反应和T细胞增殖。钱起丰等［19］检测10例尖锐湿疣患者外周血HPV16E711-20特异性CTL时,发现活化型与记忆型CTL比例显著增高。另外，13例健康人外周血单一核细胞体外经HPV16E711-20多肽刺激后，成功诱导了CD8+T细胞克隆增殖，产生特异性CTL。
2.4 其他病毒感染 在巨细胞病毒感染者外周血中能检测到0.3%甚至更高比例的抗原特异性CTL，而在急性EB病毒感染者中，该数值可达40%，但这些急性抗原特异性CTL在机体急剧下调并迅速凋亡，仅代表了短寿命的终末期效应细胞。此外在HCV、流感病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）等病毒感染者体内也检测到一定数量的抗原特异性CTL。Appay等［20］报道，在CMV感染患者体内的抗原特异性CTL存在着一定的功能缺陷，表现为其产生的穿孔素、颗粒酶及IFN-γ降低甚至衰竭。
3 结语和展望
目前，有关抗原特异性CTL作用机制尚有许多不明之处，有待进一步深入研究。深入研究抗原特异性CTL数量、表型及功能异常在病毒感染性疾病发病机制中的作用,将为临床制定有效的抗病毒治疗方案提供重要的理论依据，为临床上使用过继细胞免疫治疗开辟新途径。
目前，有关抗原特异性CTL作用机制尚有许多不明之处，有待进一步深入研究。深入研究抗原特异性CTL数量、表型及功能异常在病毒感染性疾病发病机制中的作用,将为临床制定有效的抗病毒治疗方案提供重要的理论依据，为临床上使用过继细胞免疫治疗开辟新途径。
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作者单位：广东医学院附属医院皮肤科,广东 湛江 524001; 深圳市皮肤病防治研究所,广东 深圳 518020