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【摘要】 目的 构建和鉴定微小隐孢子虫CP15/60-23基因重组卡介苗。 方法 以pET-30a-CP15/60-23质粒为模板，PCR扩增CP15/60-23基因片段，然后克隆至TA载体；通过酶切、测序鉴定后，将CP15/60-23基因片段用限制性内切酶切下定向克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV262结核杆菌热休克蛋白（HSP）启动子下游，构建重组质粒pMV262-CP15/60-23，用电穿孔将该质粒导入野生卡介苗（BCG-WT）构建微小隐孢子虫CP15/60-23基因重组卡介苗。 结果 扩增出792bp的微小隐孢子虫CP15/60-23基因片段，成功构建pMV262-CP15/60-23质粒，并通过PCR扩增和提取质粒、酶切等表明该质粒被正确导入BCG-WT中。 结论 成功构建微小隐孢子虫CP15/60-23基因重组卡介苗，为研究隐孢子虫病新的防治方法打下了基础。
【关键词】 微小隐孢子虫 CP15/60-23基因 重组卡介苗 构建 鉴定
微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)是一种属于顶端复合物门原虫, 由Tyzzer于1912在小鼠小肠内发现［1］。隐孢子虫感染引起的隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是一种以腹泻为主要症状的人畜共患寄生虫病，呈全球性分布，是引起人类腹泻的六大病因之一。免疫力正常的人感染隐孢子虫后，可引起急性腹泻，但常为自限性；但免疫功能低下者,尤其是婴幼儿和艾滋病患者感染此虫后，则可引起严重胃肠炎并伴有水样腹泻，导致大量体液丢失，甚至可危及生命,是艾滋病病人的重要致死因素之一［2］。曾发生多起水源性隐孢子虫病暴发流行［3］, 对人类公共卫生造成很大威胁。该虫生活史较复杂，各期均有与致病和免疫有关的蛋白，其中的CP15/60和CP23具有较强的免疫活性而成为免疫诊断和疫苗研制的靶抗原。本究利用分子生物学技术方法，将编码CP15/60和CP23的复合基因CP15/60-23克隆到大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV262中，经电穿孔导入BCG-WT构建重组BCG-CP15/60-23（rBCG-CP15/60-23）疫苗，为隐孢子虫病防治提供一种新方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 野生卡介苗（BCG-WT）及大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV262由美国哈佛大学公共卫生学院馈赠，pET-30a-CP15/60-23质粒由本实验室构建，大肠埃希菌DH5为本实验室保存。
1.1.2 主要试剂 TA克隆载体pMD18-T Simple Vector为TaKaRa生物工程(大连)有限公司产品；日常型质粒DNA小量快速制备试剂盒，凝胶回收试剂盒为V-gene公司产品； Taq DNA聚合酶、dNTP、T4DNA连接酶、限制酶EcoRⅠ和SalⅠ为NEB公司产品；DNA Marker为北京天为时代科技有限公司产品，MB Broth为美国BD公司产品。
1.2 方法
1.2.1 微小隐孢子虫CP15/60-23基因的扩增 CP15/60-23基因由本实验室构建，能编码CP15/60和CP23的复合基因［4］。
1.2.2 引物的设计与合成 根据Jenkins等［5］报道的CP15/60序列（GenBank接受号：U22892）和Perryman等［6］报道的CP23核苷酸序列(GenBank接受号：U34390),自行设计了一对引物：P1：Forward primer 5＇-GCGGAATTCGTAACTTGAAATCCTG-3＇,P2: Reverse primer 5＇-GCGGTCGACATTAGGCATCAGCTGGCTTGTC-3＇。P1的5＇端引入EcoRⅠ酶切位点，P2的5＇端引入SalⅠ酶切位点，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2.3 PCR扩增CP15/60-23基因 在25μl的反应体系中,加引物P1、P2各1μl,10×PCR buffer 2.5μl, MgCl2（25mmmol/L）1μl, dNTP（each 10mmol/L）1.0μl, pET-30a-CP15/60-23质粒1.0μl, Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)1.0μl，dH2O 16.5μl。设置以下循环参数：94℃预变性2min；94℃ 1min，55℃ 50s，72℃ 2min，30个循环；最后72℃延伸10min。
1.2.4 PCR产物电泳鉴定及纯化 扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，用凝胶回收试剂盒纯化回收扩增片段。
1.2.5 扩增片段的TA克隆和测序 用常规方法将CP15/60-23扩增片段直接克隆至pMD18-T Simple Vector，转化大肠埃希菌DH5，PCR初步筛选阳性，经培养和小剂量快速提取质粒后,用EcoR和SalⅠ酶切鉴定。将CP15/60-23TA克隆质粒送TaKaRa生物工程(大连)有限公司测序。
1.2.6 重组质粒pMV262-CP15/60-23质粒的构建 提取pMV262质粒和CP15/60-23TA克隆质粒，分别用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收酶切后的pMV262片段和CP15/60-23片段，用T4DNA连接酶连接（16℃,3h）。将反应体系全量转化DH5菌，涂布卡那平板，PCR法初步筛选阳性克隆，提取质粒,酶切鉴定。
1.2.7 BCG-WT的培养与转化 将BCG-WT接种添加OADC的100ml MB7H9培养基中，于37℃恒温孵育箱中培养约3周至对数生长期（A600为0.6～0.8），冰浴2h,5 000r/min离心10min，弃上清，用预冷10％的甘油洗三次，加入预冷10％的甘油1ml混匀，此菌可直接用于电转化。.取100μl菌液，加入2μl（约1μg）重组pMV262-CP15/60-23质粒，冰浴1min后转入0.2cm的电穿孔杯中进行转化。电穿孔参数设置：电压2.5kV ,电流25mA ,电阻1000，转化次数为1次，转化完毕后立即加入1ml添加OADC的100ml MB7H9培养基,37℃培养24h,取200μl含50mg/ml卡那霉素的M7H9平板培养基平板, 37℃培养3周。
1.2.8 重组BCG的鉴定 取培养基上的单菌落，加入添加OADC含50mg/ml卡那霉素的10ml MB7H9培养基，37℃培养1周，取1ml菌液离心后作为模板，PCR扩增CP15/60-23基因，循环参数同前，PCR阳性菌落继续培养2wk，用质粒提取试剂盒提取质粒（细菌裂解时加入5U的胰蛋白酶，37℃孵育1h），用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切及1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2 结果
2.1 目的基因的扩增 以pET-30a-CP15/60-23质粒为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在约790bp处见一特异扩增带, 长度与CP15/60-23基因值（792bp）相符(图1)。
图1 CP15/60-23基因PCR扩增产物电泳结果（略）
1. DNA分子质量标准；2,3. CP15/60-23基因PCR扩增产物
Fig 1 PCR amplification of CP15/60-23 gene
1. DL2000; 2,3. PCR products of CP15/60-23 gene
2.2 TA克隆载体的酶切鉴定 经挑选白斑菌落并抽提质粒DNA,用EcoRⅠ和SalⅠ酶切鉴定,结果在790bp处见明显条带。由于EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点均预设计于引物中,表明CP15/6023基因已克隆入pMD18-T载体(图2)。
图2 pMD18-T-CP15/60-23质粒的酶切鉴定结果（略）
1. DNA分子质量标准；2. 未经酶切的pMD18-T-CP15/60-23质粒；3. EcoRⅠ和SalⅠ双酶切
Fig 2 Identification of recombinant plasmid pMD18-T-CP15/60-23 by restrictive enzymes digestion
1. 1kb plus DNA ladder；2. pMD18-T-CP15/60-23 plasmid；3. pMD18-T-CP15/60-23 digested by EcoRⅠand SalⅠ
2.3 DNA序列分析 PMV-262-CP15/60-23质粒两次全部测通，其结果如下，GAATTC为EcoRⅠ酶切位点,GTCGAC为SalⅠ酶切位点，GCCCCT为多出的六个碱基，导致多了脯氨酸(P)和丙氨酸(A)两个氨基酸,但没有改变阅读框。
2.4 重组的鉴定结果 以重组BCG菌液为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在约790bp处见一特异扩增带, 长度与CP15/60-23基因值（792bp）相符(图3)。
图3 重组BCG菌液PCR扩增产物电泳结果（略）
1. DNA分子质量标准；2,3. 重组BCG菌液PCR扩增产物
Fig 2 PCR amplification of CP15/60-23 gene
1. DL2000；2,3. PCR products of CP15/60-23 gene
重组pMV262-CP15/60-23质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后，产生了一个与CP15/60-23 PCR产物相同大小的小片段和一个不同于pMV262重组质粒的大片段（图4）。
3 讨论
由于微小隐孢子虫病危害严重，目前尚无有效药物，免疫干预可能在将来成为隐孢子虫病防治的主要措施。对编码微小隐孢子虫蛋白基因的研究发现，可能作为微小隐孢子虫疫苗的基因有7类［7,8］，其中编码子孢子表面抗原的基因被公认为疫苗的侯选基因。CP15/60和 CP23为微小隐孢子虫子孢子表面蛋白，能刺激机体产生较好的免疫保护作用。Jenkins等报道小球隐孢子虫子孢子表面蛋白CP15/60是诱导保护性免疫力的主要成分，给乳鼠口服抗CP15/60的IgA单抗可以保护其免受微小隐孢子虫感染［9］。同样CP23单克隆抗体可以明显抑制微小隐孢子虫感染，重组的CP23蛋白亦可诱导产生保护性抗体，是诱导保护性免疫力的主要成分［10］。
图4 pET-30a-23质粒的酶切鉴定结果（略）
1. DNA分子质量标准；2. 未经酶切的pMV262-CP15/60-23质粒；3. SalⅠ、EcoRⅠ双酶切；4. CP15/60-23基因PCR扩增产物
Fig 4 Analysis of plasmid pET-30a-23 by restrictive enzyme cleavage
1. 1kb plus DNA ladder；2. pMV262-CP15/60-23plasmid; 3. pMV262-CP15/60-23 digested by SalⅠ and EcoRⅠ；4. PCR products of CP15/60-23 gene
基因工程重组活载体疫苗是用基因工程技术将病毒或细菌(常为疫苗弱毒株)构建成一个载体，把外源基因(包括重组多肽、肽链抗原位点等)插入其中使之表达的活疫苗。BCG因与其它细菌载体和病毒载体相比有不可比拟的优势而成为重组活载体疫苗的首选。BCG是一种减毒牛型结核分枝杆菌活疫苗，不仅可用来预防结核病而且是用于实验动物和人的最强免疫佐剂，最强的非特异免疫刺激剂。以BCG为载体构建的基因重组BCG(rBCG)可用来防治多种疾病。rBCG集佐剂和载体于一身、兼多种外源基因与活疫苗于一体，一次接种可获得强而持久的多种特异性免疫［11］。大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV262含有来自大肠埃希pUC19和分枝杆菌pAL5000复制起点，BCG热休克蛋白60（hsp60）启动子以及来自Tn903的aph基因赋予该质粒卡那霉素抗性［12］。hsp60启动子是一种高效可控启动子，在受热、过氧化物及巨噬细胞吞噬等应急情况下，可大量表达外源蛋白。在此基础上，本研究利用分子生物学技术成功构建了CP15/60-23基因rBCG。下一步将继续研究表达的活性及rBCG-CP15/60-23的免疫保护作用，以期为隐孢子虫病的防治提供了一种新的方法。
【参考文献】
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作者单位：山东省寄生虫病防治研究所，山东 济宁 272033