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【摘要】 目的 了解深圳市2007年H3N2亚型流感病毒流行情况及血凝素基因特性。 方法 用狗肾传代细胞(MDCK)和鸡胚进行流感病毒分离。收获病毒后提取病毒RNA，进行逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR），扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后送大连宝生物公司纯化及测序。测序结果用Simmonic软件和Mega3.1软件进行序列分析。 结果 H3N2亚型流感毒株为深圳市2007年流感流行的优势株,与2006年的深圳株比较未发生明显变异，但与2007年的疫苗株相比，有多个位点的氨基酸发生了替换，造成了其间的抗原性发生了一定的变化。 结论 深圳市2007年H3N2亚型流行株,并未形成一个新的变种。推测是由于与疫苗株之间的抗原性的变异导致了2007年深圳市H3N2亚型流感的流行。
【关键词】 H3N2亚型流感病毒 变异 序列分析
流行性感冒(流感，Influenza)以其病原的易变性和传播速度快而著称,流感病毒是由甲、乙、丙三型流感病毒引起的急性呼吸道传染病。据2002年世界卫生组织公布的数据，估计全球每年流感病例达6～12亿。其最显著的特点是极易发生变异，其抗原性变异的频率之高、幅度之大是自然界其他生物无法比拟的。变异可使其逃避宿主免疫的识别与清除，从而能多次反复有效地突破人群的免疫屏障，引起流感流行。每一次流感流行都给社会带来严重的经济损失，给人群造成不同程度的超额死亡率。由于其潜伏期短，经呼吸道飞沫传播，传播迅速，抗原易变异，人群对变异株普遍易感，控制难度大。引起WHO和世界各国的关注，深圳毗邻港澳,人群流动频繁,常年有流感病毒活动。自1994年以来,深圳地区被国家流感中心选为我国重点流感监测点之一,成为我国流感监测的南大门。1997年我国香港特区突发H5N1禽流感后［1］，我市又进一步加强了流感监测工作，同时在发现H9N2禽流感能感染人中做出了贡献［2,3］。2007深圳市H3N2亚型流感病毒流行活跃，并引起小规模的暴发。为了解其变异情况,本文对2007年深圳市H3N2亚型流感病毒进行了血凝素基因序列测定，并对测定结果进行了分析。
1 材料与方法
1.1 标本来源 2007年在深圳市监测点医院采集到的流感样病例鼻咽拭子。
1.2 病毒分离培养及鉴定 将鼻咽拭子标本同时接种狗肾传代细胞（MDCK细胞）和9～11d龄鸡胚进行流感病毒分离培养。连续接种两代后，血凝试验阳性培养液用病毒病所国家流感中心提供的流感分型试剂盒进行血凝抑制实验（HAI），以鉴定其型别及亚型［4］。
1.3 病毒RNA提取 用High Pure Viral RNA Kit（Roche）试剂盒对病毒进行RNA提取。
1.4 HA基因的扩增 引物1：5’ -GCA GTA CCA AAC GGA ACG AT-3’，下游引物为： 5’- ATG CCT GAA ACC GTA CCA AC-3’，以上引物由大连宝生物公司合成。病毒RNA经逆转录合成cDNA，后用PCR扩增。取6μl流感病毒RNA作为模版，进行反转录。反转录条件为：42℃ 1h，70℃ 15min后放冰上冷却。取5μl cDNA作为模版进行PCR，PCR条件为：95℃ 2min，［94℃ 10sec, 51℃ 30 sec，72℃ 105sec］ 34cycles；72℃ 5min，4℃。
1.5 核苷酸序列测定及分析 PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，送大连宝生物公司进行产物纯化并测序。用Simmonic及Mega（version3.1）软件对测序结果进行分析，同时与2006年、2007年WHO推荐的北半球H3亚型疫苗株A/California/7/2004、A/Wisconsin/67/2005（其在Influenza Sequence Database上的序列号分别为EU247848,EU097768），2007年国内H3亚型代表株A3/江西东湖/312/06（其序列由病毒病所国家流感中心提供。），以及2006年深圳分离到的H3N2亚型流感病毒进行序列和种系进化分析。
2 结果
2.1 2007年深圳市H3N2亚型流感病毒流行情况 2007年，深圳市共分离到流感病毒318株，其中H3N2亚型211株（66.4%）。其在6月达到分离高峰，并引起了小规模的暴发，成为了2007年深圳流感流行的优势株。
2.2 氨基酸种系进化分析 按照采样时间，随机选取了15株2007年深圳H3N2亚型流感毒株进行了氨基酸序列测定，分析了其HA片段氨基酸变异情况，并与2006年深圳株及其他参考毒株进行了氨基酸种系进化分析。
从图1中的氨基酸种系发生树可以发现,除了SZ/47/07及SZ/98/07在分支A上，其余所有2007年分离到的H3N2亚型流感病毒均分布在由SZ/24/06进化而来的分支B中。而同时A/California/7/2004、A/Wisconsin/67/2005及A3/江西东湖/312/06均处在分支A上。结合HA片段氨基酸变异位点来看，是G50E及K140I造成了A、B的分支。
图1 2007年深圳市H3N2亚型流感病毒HA基因进化分析（略）
2.3 氨基酸序列的变异及蛋白分子结构变化的分析 本研究在完成氨基酸种系进化分析后，同时对以上毒株进行了HA1片段氨基酸序列的变异及蛋白分子结构变化的分析（见图2）。
图2 深圳市2007年H3N2亚型流感病毒HA氨基酸序列比较（略）
__ ：糖基化位点
2.3.1 抗原决定簇位点的变异情况 目前在人群中流行的A型流感病毒HA上共有A、B、C、D、E五个抗原决定簇。A位于由140～146位氨基酸构成的突出环上及133～137位氨基酸；B位于155位上面的主环(156～160)及球区末端围绕α螺旋结构的187～198位氨基酸；C位于球区下方53, 54, 275和278所在的区，由52位Cys与277位Cys间二硫键相连所形成三维结构的膨胀部；D位于HA三聚体交界处，由207, 172～174位等表面氨基酸组成；E是由63, 78, 81, 83位形成的表面氨基酸区。上述抗原决定簇的氨基酸发生替换,一般均会引起HA蛋白的抗原性漂移。经比较发现，与A/California/7/2004相比较，所有2006、2007年深圳流行的H3N2毒株均在B抗原决定簇位点上发生了氨基酸变异: N188D、S193F、T196A。而其余四个抗原决定簇位点上氨基酸相对保守，未发生变化。
2.3.2 受体结合位点的变异情况 唾液酸是流感病毒感染细胞时与细胞表面结合的受体，而与唾液酸结合的流感病毒HA1蛋白上的受体结合位点（RBS）。RBS呈口袋状，位于HA1分子的球区末端，口袋底部由98和153位的氨基酸构成，后壁由183位, 190位和194位的氨基酸构成，左侧壁为196, 202, 222和225～228位氨基酸构成，前壁由131～137位构成，右壁为一长槽形，以155位Thr结尾。经比较发现，所有2006、2007年深圳流行的H3N2毒株在225位上的氨基酸均为N，其余RBS位点的氨基酸未见变异。
2.3.3 糖基化位点与二硫键的变异情况 对于糖基化位点的分析发现，所有除去sz/98/07及sz/47/07，其他的2007年深圳株均在HA1片段有10个糖基化位点，即第8、22、38、63、126、133、144、165、246、285位点。而sz/98/07及sz/47/07由于在144位点上发生Asn到Asp的变异，造成在HA1片段只有9个糖基化位点。
对14、137、52、277、64、76、97、139、281、305位上的二硫键进行分析，未发现氨基酸替换现象。
2.3.4 HA1其它位点上的氨基酸变异情况 除去在前中提到的大部分2007年深圳株出现G50E及K140I外，所有的2007年深圳株与疫苗株Wisconsin/67/05相比在138位上发生了Ser到Lys的替换。其余还存在个别的点变异：I151M、I153N、Q156R、I158V、R142G。
3 讨论
KoSasa等通过实验自接证明HA是决定流感病毒毒力的一个关键［5］,HA蛋自通过不断改变来逃避宿主免疫系统而蛋白通过不断改变来逃避宿主免疫系统,而编码的HA1为抗原和受体的结合位点,并且为流感病毒基因组中最容易发生突变的区域,通过免疫系统的选择压力,基因不断发生变化。目前认为主要是由于编码蛋白基因一系列点突变的积累导致了氨基酸序列改变的积累,改变了蛋白分子上的抗原位点［6］。血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是流感病毒的主要表面抗原,蛋白可识别靶细胞受体并与受体结合,具有与宿主细胞融合活性,并能诱导产生保护性中和抗体。基因具有高度易变性,是流感病毒发生抗原性漂移的主要原因。本研究通过对HA1片段上的各蛋白分子结构及氨基酸序列进行分析，发现2007年深圳分离到的H3N2亚型流感毒株与2006年的深圳株相比较，抗原决定簇位点及二硫键都相对保守，只有少数毒株缺少了一个糖基化位点。一般认为,一个新的变种,必须在A抗原决定簇的1区蛋白分子上有4个以上氨基酸序列发生了替换,而且替换必须涉及到2～3个抗原决定簇位点上 ,所以深圳市2007年H3N2亚型流行株,还未形成一个新的变种。
但是结合氨基酸进化树的分析结果、HA片段氨基酸序列分析及深圳市2007年H3N2亚型流感毒株的流行情况，发现2007年的深圳H3N2流行株已与2007年的疫苗株A/Wisconsin/67/2005之间的抗原性发生了一定的变化，可以推测正是由于这种抗原性的变异导致了2007年深圳市H3N2亚型流感的流行。
【参考文献】
［1］ Subbarao K,Alexander K, Jacqueline K. Characterization of an avain influenza A(H5N1)virus isolated from a child with a fatal respiratory illness［J］.Science,1998,279:393～396.
［2］ 单芙香，程小雯,何建凡,等.深圳地区人和鸡群中H9N2亚型流感病毒病原学和血清流行病学调查［J］.中华试验和临床病毒学杂志,2002,16:319～321.
［3］ 郭元吉,李建国,程小雯,等.禽H9N2亚型流感病毒能感染人的发现［J］.中华试验和临床病毒学杂志,1999,13:105～108.
［4］ 郭元吉,程晓雯.流行性感冒病毒及其实验技术［M］.北京:三峡出版社,1997,133～136.
［5］ Kobasa D,Takada A,Shinya K,et al.Enhanced virulence of influenouenza A viruses with the haemagglutinin of the 1918 pandem is virtis［J］.Nature,2004, 431(7009): 703～707.
［6］ Smith DJ, Lapedes As,de Jong JC,et al.Mapping the antigenic and genetic evolution of influenza virus［J］.Science, 2004, 305(5682):371～376.
作者单位：深圳市疾病预防控制中心, 广东 深圳 518020