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【摘要】 目的 调查深圳地区不孕妇女的生殖道沙眼衣原体(CT)和解脲支原体(UU)感染；比较荧光定量PCR法与UU培养或金标法检测CT的敏感性。 方法 219例不孕妇女患者取宫颈分泌物,用荧光定量PCR法检测219例分泌物标本UU的DNA,同时对196例标本进行CT的DNA检测。另选68例正常体检女性作为对照组;同时采用支原体培养药敏试剂盒进行UU培养以及金标法检测CT,并对结果进行统计、分析。 结果 荧光定量PCR检出UU阳性率39.7%(87/219), CT阳性率44.9% (88/196)，分别高于对照组（P<0.05）。同时，培养法检出UU阳性率为29.7%，金标法检测CT阳性率为27%，与PCR相比，P<0.05。 结论 输卵管不孕妇女生殖道UU和CT检出率较高, 荧光定量PCR具有敏感性高和特异性强的特点，对不孕患者CT和UU的诊疗具有实际意义。
【关键词】 不孕 解脲支原体 沙眼衣原体 金标法 荧光定量PCR
解脲支原体(Ureaplasma urealyticum,UU)和沙眼衣原体(Chlaydia trachomatis,CT)感染不仅造成广泛的生殖道感染,并且导致不育,其发病率近年呈上升趋势［1］。为了解不孕妇女生殖道UU 和CT感染情况,用荧光定量PCR(Real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)检测了219例不孕妇女UU的DNA,同时对其中196例患者进行CT的DNA检测,结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源 深圳恒生医院妇科门诊2004～2007年就诊的输卵管不孕妇女患者219例,年龄22～43岁,平均为33.1岁。其中196例患者检测UU和CT,另外23例患者只检测UU。对照组68名女性, 年龄21～38岁,平均为32岁，来自正常体检人群。
1.2 样本采集 以专用无菌拭子插入宫颈口内1～2cm,缓慢转动数次并停留数秒后,将棉拭子置入1ml无菌试管中,密闭送检。
1.3 仪器和试剂 BIOER实时荧光PCR扩增仪(杭州博日科技有限公司), TGL-16G 高速台式离心机(浙江金龙仪器设备有限公司), HB2100型恒温金属浴(杭州博日科技有限公司), FX215002Ⅱ2B2 型生物安全柜(上海瑞仰净化装备公司)。CT和UU核酸扩增荧光检测试剂盒由深圳市匹基生物工程股份有限公司提供，Chlamydia抗原检测卡为杭州艾康生物技术有限公司生产，支原体培养试剂盒由珠海丽珠试剂有限公司提供。
1.4 荧光PCR 将棉拭子上的分泌物洗入1ml无菌生理盐水中，取100μl此液加入100μl DNA抽提液1中，振荡混匀, 13 000rpm/min离心10min,弃上清液, 在沉淀中加入50μl DNA抽提液2，振荡混匀,煮沸10min，13 000rpm/min离心10min,此上清液作为DNA扩增反应的模板。反应条件为: 37℃ 5min, 94℃ 1min, 95℃ 5 s，60℃ 40s，进行40个循环。反应结束后,由计算机自动分析结果。每次检测均设阳性、阴性对照和标准曲线。荧光强度>1×103copy/ml为阳性。
1.5 金标法检测沙眼衣原体 将采集到粘膜上皮的棉拭子置入样品处理管中,按试剂盒说明处理样品，然后加3滴样品处理管中的样品至抗原检测卡的样品处理孔中,10min后观查结果。同样方法分别用热灭活衣原体及热灭活B链球菌做为阳性和阴性对照。判断标准:对照区有一条红线、检测区无红线者为阴性,对照区与检测区均为红线者为阳性,对照区不出现红线者为无效结果。
1.6 支原体培养 一般取材后2h内接种,将标本接种于培养瓶中,37℃培养24h.培养基由黄变红即为阳性。
1.7 统计学方法 用SPSS10.0统计软件进行统计学分析，采用χ2检验。
2 结果
2.1 219例标本用荧光定量PCR检出87例UU阳性，阳性率为39.7%；与培养法（65例UU阳性, 阳性率为29.7%）相比，P<0.05，且随着基因拷贝数的增加，培养法的阳性检出率越高（见表1）。
表1 FQ-PCR和培养法检测UU感染结果（略）
2.2 对219例标本中的196例标本进行荧光定量PCR检测CT的DNA,检出89例CT阳性，阳性率为44.9%;金标法检出53例CT阳性，阳性率为27%, 结果见表2。FQ-PCR阳性检出率明显高于金标法（P<0.05）。
表2 FQ-PCR和金标法检测沙眼衣原体感染结果（略）
2.3 CT、UU 检出率 输卵管不孕妇女生殖道CT检出率为46.4%（88/196）, UU检出率为39.7%（87/219）,分别与对照组相比P<0.05，结果见表3。
表3 输卵管不孕妇女生殖道CT和UU DNA检出结果（略）
注:﹡与对照组相比，P<0.05。
3 讨论
CT和UU感染后可引起非淋菌性尿道炎，宫颈炎、子宫内膜炎、输卵管炎、盆腔炎等。输卵管发生炎症后，可引起输卵管管腔阻塞，导致不孕症。UU还能黏附精子，阻碍精子运动，干扰精子与卵子的结合，对精子造成免疫损伤等作用。
CT、UU的感染隐匿，因此，快速、灵敏、特异的诊断方法是预防衣原体、支原体的关键。目前确诊UU、CT感染最可靠的检测方法是支原体或细胞培养法，一直被视为检测UU、CT的金标准，但耗时，对环境条件要求高（标本的采集、运输等），且细胞易被其他的细菌或病毒污染而影响培养结果；血清学检测虽简便、快速，但无法提供现症感染资料;FQ-PCR是近几年发展起来的, 它是融汇了PCR高敏感性、分子杂交技术高特异性和光谱技术高精确定量三大技术的一种新的检测方法。能快速、高特异、高敏感、定量、无污染的检测病原体,还可以以量化指标来评估疗效，可作为临床检测实用方法,尤其适用于CT、UU感染的早期诊断和无症状携带者的检查。本组资料显示,PCR检出CT(44.9%)、UU(39.7%)阳性率高于金标法（27%）和UU培养法（29.7%），且随着PCR基因拷贝数的增加，培养法检出UU的阳性率越高，这可能是由于PCR的高灵敏度、高特异性以及培养法本身的限制之故［2］。另外，不孕妇女中CT、UU检出率明显高于对照组，与文献报道结果一致［3］。所以，加强不孕妇女CT、UU的检查具有重要的临床意义。
综上所述，输卵管不孕妇女生殖道CT、UU感染率很高，荧光PCR特异性强，敏感性高，对不孕妇女CT、UU感染的早期诊断和治疗效果的评价有实际意义。
【参考文献】
［1］ Takahashi S, Takeyama K, Kunishima Y, et al. Analysis of clinical manifestations of male patients with urethritis［J］. J Infe Ct Chemother, 2006, 12(5):283～286.
［2］ 刘友生,曹鹏飞,顾孔珍.邵阳地区泌尿生殖道支原体的检测及药敏分析［J］.实用预防医学杂志,2006,3(1):179～181.
［3］ 李传杰,梁金.荧光定量PCR检测不孕不育患者解脲支原体和沙眼衣原体［J］. 临床和实验医学杂志,2006,5(1):40～41.
作者单位：深圳恒生医院检验科,广东 深圳 518102