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【摘要】 目的 研究肝干细胞癌变的可能性。 方法 取孕14d的小鼠胚胎肝细胞作为肝干细胞移植到雌性小鼠肝脏，二乙基亚硝胺诱导肝癌。6个月后取肝癌结节做连续切片，免疫组化或免疫荧光分析Y染色体性别决定区域蛋白(SRY)、AFP、胎盘型谷胱苷肽转移酶（GST-P）或角蛋白19的表达，以研究肝癌的细胞来源和特征。 结果 6个月后诱导多发性肝癌结节。实验组17.1%的肝细胞癌结节SRY染色阳性，胆管细胞癌结节SRY染色均为阴性。肝细胞癌结节表达AFP和GST-P，而不表达角蛋白19。胆管细胞癌结节不表达AFP和GST-P，而表达角蛋白19。 结论 移植的肝干细胞转变为肝癌，并且保持了胚胎肝干细胞未成熟的特征，仍表达GST-P和AFP。提示在诱导肝癌过程中移植的肝干细胞有直接癌变形成肝细胞癌潜能。
【关键词】 肝癌 胚胎肝脏 肝干细胞 癌变
迄今为止，还不清楚肝癌起源于何种细胞［1,2］。有两类细胞可能是肝癌的细胞起源：一种是肝干细胞（或肝祖细胞），另一种是成熟肝细胞。肝干细胞存在于成体肝脏Hering管附近的卵圆细胞和胚胎肝脏内的肝祖细胞［3,4］。越来越多的研究提示肝癌由肝干细胞恶性转化而来，是干细胞成熟受阻的结果［5］。然而，干细胞与肝癌的直接关系未见文献报道。本研究应用胚胎肝细胞作为肝干细胞移植给雌性小鼠，持续诱导肝癌，探讨肝干细胞癌变的潜能。
1 材料与方法
1.1 材料 ①实验动物：6-8周龄的BALB/c小鼠，体重20～25g，购于中山大学医学动物中心。②主要试剂：二乙基亚硝胺（DEN，Sigma-Aldrich）。抗体包括兔抗甲胎蛋白（AFP）多克隆抗体(Santa Cruz, CA)，兔抗白蛋白多克隆抗体(Dako, Denmark)，羊抗细胞角蛋白19（cK19）单克隆抗体 (Santa Cruz，CA)，兔抗胎盘型谷胱苷肽转移酶（GST-P）多克隆抗体(Stressgen,Canada)，羊抗Y染色体性别决定区域蛋白(SRY)多克隆抗体(Santa Cruz, CA)。
1.2 胚胎肝祖细胞的分离和移植 雌雄小鼠同笼24h后分开，记为0d，取孕14d的胚胎肝脏，胶原酶消化法分离胚胎肝细胞。分离的胚胎肝细胞作为肝干细胞，被认为由50%的雄性细胞和50%的雌性细胞组成。雌性小鼠麻醉后行2/3肝切除，分离的胚胎肝细胞经肠系膜静脉注射到肝脏，每只小鼠移植1×106个细胞。
1.3 动物分组及二乙基亚硝胺（DEN）诱导肝癌 70只雌性小鼠随机分为3组：A,正常对照组(n=10），肝干细胞移植及饮正常水；B, 动物模型组(n=30），饮水中加DEN诱导肝癌；C,实验组(n=30），肝干细胞移植及饮含DEN的水。
术后小鼠恢复1周，DEN加入饮用水中，浓度为100μg/L，连续饮用12周诱导癌变［1］。诱癌第4、5月各取2只小鼠肝脏标本检查肿瘤形成情况。其余小鼠在诱癌后第6个月麻醉后取肝脏石蜡包埋。取肝癌结节做厚5цm的连续切片。
1.4 肝脏病理学检查 取孕14d、18d的胚胎肝脏及出生1d、7d的新生鼠肝脏做HE染色。孕14d的胚胎肝脏用免疫组化分析AFP、白蛋白、CK19、GST-P的表达。取实验组35个肝细胞癌结节和5个胆管细胞癌结节标本的连续切片，分别做HE染色及免疫组化或免疫荧光(SRY、AFP、GST-P、CK19)。用SRY的表达确定小鼠肝肿瘤来源于移植肝干细胞［6］。用AFP、GST-P、CK19的表达来鉴定肿瘤细胞的特征。
1.5 统计学分析 计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用One-Way ANOVA分析。采用SPSS 10.0统计软件包分析，P<0.05为有统计学差异。
2 结果
2.1 胚胎肝祖细胞的特征 孕14d的胚胎肝脏见散在分布的肝细胞，细胞核大，胞浆少，核质比例大，细胞形态不均一。孕18d的胚胎肝脏内的肝细胞增多，细胞核仍较大，胞浆少。出生1d、7d的新生鼠的肝细胞体积大，胞浆丰富，核质比例减小，细胞形态趋于均一。结果显示孕14d的胚胎肝细胞呈现肝干细胞的特征，数量少。随着孕期延长，胚胎肝干细胞逐渐成熟及肝细胞数量增加。孕14d的胚胎肝脏内肝祖细胞表达AFP、白蛋白、CK19、GST-P，阳性染色分布于细胞质(图1，A-D)，其表达反映了胚胎肝脏的干细胞特征。这类细胞约占肝脏内细胞的20%。
图1 孕14d小鼠胚胎肝脏的特征（IHC,×200）（略）
(A) 表达AFP；(B) 表达白蛋白；(C) 表达角蛋白19；(D) 表达GST-P。
2.2 诱癌小鼠的成活率和成瘤率 6个月后，诱癌模型组有8只存活，成活率为30.8%；诱癌实验组有9只成活，存活率为36.9%，两组间的存活率无显著差异（P>0.05）。诱癌成活的17只小鼠有15只检出肝癌，诱癌率为88.2%。两组间的诱癌率无显著性差异(P>0.05)。肿瘤在肝脏形成多发灶，癌结节有5～10个，直径3～10mm。13只为肝细胞性肝癌，2只为胆管细胞性肝癌，两组间的肿瘤病理类型无显著性差异(P>0.05)。
2.3 移植肝干细胞的癌变及特征 用SRY免疫组化的方法追踪移植肝干细胞的癌变。实验组8只小鼠成功诱导肝癌，包括7只为肝细胞癌和1只为胆管细胞癌。取其中35个肝细胞癌结节和5个胆管细胞癌结节的连续切片分析SRY、GST-P、AFP及CK19的表达，以研究肿瘤结节的细胞来源和特征。结果发现6个肝细胞癌结节的癌细胞SRY染色呈阳性，阳性率为17.1%(图2，A)。而5个胆管细胞癌结节的癌细胞SRY染色均为阴性(图3，A)。检测SRY阳性的肝细胞癌结节GST-P、AFP或CK19的表达，发现这些肝细胞癌结节表达AFP和GST-P(图2，B、C)，而不表达CK19(图2，D)。胆管细胞癌结节不表达AFP和GST-P(图3，B、C)，而表达CK19(图3，D)。结果说明移植的胚胎肝干细胞转变为肝细胞癌，并且保持了肝干细胞未成熟的特征（如表达GST-P和AFP）。
图2 SRY阳性肝癌结节AFP, GST-P 和角蛋白19的表达（略）
（A）肿瘤细胞SRY表达阳性（IHC,×200）；B：肿瘤细胞AFP表达阳性（IHC,×200）；C：肿瘤细胞GST-P表达阳性（IF,×200）；D：肿瘤细胞角蛋白19表达阴性（IHC,×200）。
图3 胆管细胞癌结节AFP, GST-P 和角蛋白19的表达（略）
（A）肿瘤细胞SRY表达阴性（IHC,×200）；B：肿瘤细胞AFP表达阴性（IHC,×200）；C：肿瘤细胞GST-P表达阴性（IF,×200）；D：肿瘤细胞角蛋白19表达阳性（IHC,×200）。
3 讨论
在正常情况下，肝细胞有潜在的增殖能力，而不需要肝干细胞的增殖。卵圆细胞是成体肝脏内潜伏的干细胞［3］。当存在严重肝损害时，卵圆细胞将被激活增殖和分化为肝细胞和胆管细胞。孕14d的小鼠胚胎肝祖细胞被认为是肝干细胞［4］。检测未成熟肝细胞的标志物如GST-P 和甲胎蛋白，来鉴定孕14d的小鼠胚胎肝祖细胞是否代表肝干细胞。本实验结果显示胚胎肝脏内有20%的细胞是肝干细胞。
肝癌的细胞起源有两种假说：一种认为由肝内干细胞成熟受阻异常分化而来，另一种认为由成熟肝细胞去分化而来。肝癌的细胞起源一直备受争议［1,2］。在致癌剂作用下，细胞的增殖是把任何基因损伤固定成可传代的形式的关键因素。因此，在肝脏内任何增殖的细胞都有瘤性转化的倾向。
肿瘤是干细胞疾病的观点越来越被人们所接受［7］。肝干细胞比成熟肝细胞寿命长，对化学致癌毒性作用的耐受性比肝实质细胞强，有更多的机会和足够长的时间接受两次或多次突变而发生肿瘤，增殖状态的肝干细胞更易受致癌因素的影响而突变。另外，干细胞癌变维持这种增殖能力比肝细胞癌变打开这一通路更容易，也就是说保持自我更新需要更少的基因突变。肝干细胞比成熟肝细胞更有可能成为肝癌癌变的靶细胞。以往的研究提示肝癌的发生与肝干细胞关系密切。Dumble等观察到卵圆细胞参与肝癌组织发生的直接证据，他们从敲除p53小鼠的肝脏分离卵圆细胞，当这些细胞移植到无胸腺的裸鼠能形成肝细胞癌［8］。
本实验主要目的是研究肝癌的细胞起源。本实验中，DEN诱导SRY阳性的肝细胞癌，这些细胞来源于移植的肝干细胞。这些HCCs表达AFP、GST-P，其形态学与肝干细胞类似，而与肝细胞不同。AFP被认为是细胞去分化或未成熟的标志。GST-P在胚胎肝细胞内表达，在药物诱导的肝癌形成过程中病灶内GST-P的表达逐渐增加，GST-P也是肝癌癌变的可靠指标。确定肝细胞癌的细胞起源的关键在于肝细胞癌的早期病变。如果干细胞成熟受阻的假设成立，这些肝癌细胞将呈现肝干细胞的特征。但如果成熟肝细胞去分化的假设成立，早期肝细胞癌将拥有成熟肝细胞的特征。因此，我们认为SRY阳性的肝细胞癌来源于移植的肝干细胞，这些干细胞在恶性转化和癌变过程中持续表达AFP和GST-P，在癌变过程中始终显示未成熟的特征。也就是说，移植的SRY阳性的肝干细胞直接癌变为SRY阳性的肝癌细胞，而不是移植的SRY阳性的肝干细胞先分化为成熟的肝细胞后再去分化癌变为肝细胞癌。
综上所述，我们的结果显示在DEN诱导肝癌的模型中，移植的肝干细胞直接转化为肝细胞癌。这提供了肝细胞癌起源于干细胞的实验依据。
【参考文献】
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作者单位：海南省人民医院肝胆外科,海南 海口 570311; 中山大学附属第一医院肝胆外科,广东 广州 510080