抗纤软肝方对刀豆蛋白A致小鼠免疫性肝损伤的保护作用

【摘要】  目的 探讨抗纤软肝方对刀豆蛋白A（Con A）所致免疫性肝损伤的保护作用。 方法 72只NIH小鼠随机分为6组，分别为正常对照组,模型组、抗纤软肝方高剂量组、中剂量组、低剂量组(20.0、10.0、5.0g/kg)和联苯双酯（150mg/Kg）治疗组。除正常对照组外，其他组小鼠于实验首日静脉注射ConA 20mg/Kg，抗纤软肝方高、中、低剂量组和联苯双酯组均灌胃给药，每天1次，连续3d，末次给药后4h，再次静脉注射ConA 20mg/kg，8h后检测血浆谷丙转氨酶（ALT）活性、干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF-α)含量，观察肝组织病理学变化。 结果 抗纤软肝方高、中、低剂量组小鼠ALT活性、IFN-γ和TNF-α含量均明显低于模型组，差异有显著性意义(P<0.01)；抗纤软肝方三个剂量组肝脏病理改变明显减轻。 结论 抗纤软肝方对ConA所致小鼠免疫性肝损伤具有较好的保护作用，抑制T淋巴细胞活化和IFN-γ、TNF-α的释放是其主要的作用机制。

【关键词】  抗纤软肝方 刀豆蛋白A 肝损伤 干扰素γ 肿瘤坏死因子-α

刀豆蛋白A(Con A)诱导的小鼠肝损伤实验动物模型，其病理特点主要是通过活化T淋巴细胞而致免疫性肝损伤，与D-氨基半乳糖模型、四氯化碳模型等中毒性肝损伤模型相比，该模型被认为更适合研究人类病毒性肝炎、自身免疫性肝病等的病理机制和进行抗肝损伤的药物筛选［1,2］。本研究以NIH小鼠为实验对象，探讨抗纤软肝方对Con A所致免疫性肝损伤的保护作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  NIH小鼠, 雄性, 体重18～22g,广东省医学实验动物中心提供,许可证号：粤SCXK(粤)2003-0002。刀豆蛋白A为美国华盛顿生物药品公司产品；抗纤软肝方的组方药材包括叶下珠、虎杖、桃仁、柴胡、甘草等购自广州中医药大学第一附属医院，经水提浓缩至相当于生药2.0g/ml。联苯双酯滴丸，北京协和药厂生产，批号：05050107，每滴丸含联苯双酯7.5mg。 谷丙转氨酶（ALT）检测试剂盒为上海荣盛生物技术有限公司提供，小鼠干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF-α)定量检测试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。Bio-Tek ELX8000自动酶标仪(Bio-Tek instrument INC )，752型紫外分光光度计（上海第三分析仪器厂），Olympus CK40-F200显微镜（Olympus Optical Co. Ltd）。

　　1.2  实验方法

　　1.2.1  动物分组处理  72只NIH小鼠随机分为6组，每组12只，分别为正常对照组、模型组、抗纤软肝方高剂量组、中剂量组、低剂量组(20.0、10.0、5.0g/kg,相当于10倍、5倍、2.5倍临床用药剂量)、联苯双酯（150mg/kg）治疗组，除正常对照组外，其余小鼠于实验首日上午尾静脉注射Con A 20mg/kg，并于首日、次日和第3d下午各给药1次，抗纤软肝方高剂量组、中剂量组、低剂量组和联苯双酯治疗组均灌胃口服，末次给药后4h，模型组和各给药组小鼠一次性静脉注射Con A 20mg/kg，禁食,不禁水,8h后摘小鼠眼球取血，离心分离血浆；取肝左叶组织，10%甲醛溶液固定。

　　1.2.2  血浆ALT活性检测  采用赖氏法，按试剂盒说明操作，用752型紫外分光光度计于波长505nm处检测吸光值,制定标准曲线,换算成ALT值。

　　1.2.3  血浆IFN-γ和TNF-α定量测定  采用双抗体夹心ABC-ELISA法，按试剂盒说明操作，用Bio-Tek ELX8000自动酶标仪于波长490nm处检测吸光值,制定标准曲线,换算成IFN-γ和TNF-α定量值。

　　1.2.4  病理组织学观察  10％甲醛溶液固定肝组织, 石蜡包埋切片，常规HE染色后行光镜病理观察。

　　1.3  统计学方法  采用SPSS10.0软件包进行统计分析,多组计量资料分析采用One way ANOVA,多重比较采用LSD。

　　2  结果

　　2.1  抗纤软肝方对Con A所致肝损伤小鼠血浆ALT、IFN-γ和TNF-α的影响  由表1可知，模型组小鼠ALT活性、IFN-γ和TNF-α含量较正常对照组明显升高，两者比较差异均有显著性意义(P<0.01)。
   
　　抗纤软肝方高剂量组、中剂量组和低剂量组小鼠ALT活性、IFN-γ和TNF-α含量均明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)。抗纤软肝方高剂量组小鼠ALT活性、IFN-γ和TNF-α含量均明显低于中剂量组和低剂量组，差异有统计学意义(P<0.01)，但与联苯双酯组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。抗纤软肝方中剂量组小鼠ALT活性明显低于低剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)，但与联苯双酯组比较，差异统计学意义(P>0.05)。

　　表1  抗纤软肝方对Con A所致肝损伤小鼠血浆ALT活性、IFN-γ和TNF-α含量的影响（略）

　　注：与正常组比较,△P<0.01；与模型组比较,*P<0.01。

　　2.2  肝组织病理学观察  光镜下可见，正常组肝小叶结构正常，肝细胞形态规则，排列整齐，汇管区结构清晰，肝窦未见异常。模型组全部小鼠肝组织均出现明显病变，小叶内大多数肝细胞肿胀，细胞质疏松化，有的呈气球样变，可见明显的点状坏死和灶性坏死，坏死灶可见大量炎性细胞浸润；汇管区淋巴细胞和单核细胞炎性浸润尤为明显,肝窦内可见红细胞堆集。抗纤软肝方高、中、低剂量组和联苯双酯组部分肝组织可见散在点状坏死和灶性坏死，肝细胞损伤程度与模型组相比明显减轻，炎性细胞浸润显著减少( 图1）。

　　图1  小鼠肝组织学，HE染色，×200（略）

　　3  讨论
   
　　Con A是一种被广泛应用可活化T细胞的有丝分裂原，Con A静脉注射小鼠体内后，大部分在肝脏内聚集，表明肝脏是Con A体内诱导毒性的靶器官［1］。ConA活化TH细胞后刺激TH细胞和巨噬细胞共同产生过量的IFN-γ和TNF-α等细胞因子，已证实TNF-α为细胞因子网络中介导肝损伤的终末介质，它既是肝细胞凋亡的正性触发因子,且直接损伤血管内皮细胞，亦可活化中性粒细胞促进其趋化聚集于肝脏，释放蛋白酶或氧自由基引起肝细胞凋亡或坏死［3,4］。其次，体内大量活化的T淋巴细胞与细胞因子IFN-γ等随血流到达肝脏，直接与肝细胞接触或进一步激活巨噬细胞、破坏血管内皮细胞导致肝损伤［5,6］。细胞因子IFN-γ、TNF-α是引起急性肝损伤的重要炎症介质［7］,T淋巴细胞活化后产生的IFN-γ是巨噬细胞的重要激活剂，对促进肝内Kupffer细胞参与炎症反应和刺激巨噬细胞分泌TNF-α起作重要作用［8］。研究表明，预先给予抗-TNF-α, 或抗-IFN-γ，均可完全阻断Con A诱发的小鼠肝损伤［3,9］。
   
　　抗纤软肝方由叶下珠、虎杖、桃仁、柴胡、甘草等药物组成，临床上主要用于慢性乙型肝炎和肝纤维化的治疗，研究证实该复方对二甲基亚硝胺诱导的实验性肝纤维化形成有较好的抑制作用［10］。本研究结果显示，抗纤软肝方三个剂量组对Con A诱发的小鼠急性免疫性肝损伤模型，均具有明显的保护作用，表现为谷丙转氨酶降低、肝组织病理变化减轻；抗纤软肝方各治疗组血浆TNF-α和IFN-γ含量明显低于模型组(P<0.01)，表明抗纤软肝方可通过抑制T淋巴细胞活化和IFN-γ、TNF-α的释放发挥抗肝损伤作用；抗纤软肝方对ALT活性和TNF-α、IFN-γ含量的影响，呈现明显的量效关系，该结果为抗纤软肝方的进一步开发和临床应用提供了依据。

【参考文献】
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作者单位：广州中医药大学基础医学院，广东 广州 510405； 广州中医药大学热带医学研究所，广东 广州 510405