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【摘要】 目的 研究IGF1、IGF2在胃肠道间质瘤(GISTs)组织中的表达与临床病理学特征的关系及其相互间的相关性。 方法 应用免疫组化SABC法检测55例胃肠道间质瘤中IGF1和IGF2的表达情况，结合临床病理学资料（性别、组织学分型、肿瘤直径、组织学分级及部位）分组比较并进行统计学分析。 结果 55例GISTs中IGF1和IGF2的阳性表达率分别为61.8%（34/55）和49.1%（28/55）。不同肿瘤直径及组织学分级之间IGF1和IGF2的阳性率有显著性差异（P<0.05），但与性别、组织学分型、部位、肿瘤结节数、原发/复发之间无关（P>0.05）。 结论 IGF在GISTs的发生和增殖中发挥作用，可能为GISTs良恶性的判断提供依据。
【关键词】 胃肠道间质瘤 胰岛素样生长因子I 免疫组织化学
胃肠道间质瘤(Gastrointestinal stromal tumors, GISTs)是发生于消化道最常见的间叶性肿瘤。GISTs源于多潜能的卡哈尔间质细胞样的前体细胞［1］，CD117和CD34的免疫组化染色是目前诊断GISTs较为可靠的方法。由于GISTs的生物学行为难以预测［2］，我们希望找到一些与GISTs恶性潜能相关的客观指标，从基因水平探讨GISTs发生和发展的规律，进而指导临床治疗和判断预后。细胞凋亡调控基因IGF和IGFR是近年来肿瘤学研究的热点。本研究应用免疫组化法检测55例GISTs中IGF1（Insulin-like growth factor 1）和IGF2的表达，并分析其与临床病理学特征的关系及相关性。目前国内外尚未见GISTs与IGF关系的相关报道。
1 材料与方法
1.1 材料 选择中山大学附属第二医院病理科2000～2004年原发于消化道、原诊断为胃肠道平滑肌 (肉)瘤或富于细胞平滑肌瘤、神经鞘瘤的病例共68例，经过CD117和CD34检测证实为胃肠道间质瘤的标本55例，参考侯英勇提出的诊断标准［3］：良性指标：肿瘤小于5cm或核分裂小于5/50HPF，且细胞成分少、器官样生长、无细胞多形性、无黏膜侵犯或坏死；恶性指标：黏膜侵犯、肿瘤坏死和显著的细胞多形性、核分裂大于10/50HPF；界于良性和恶性之间的为潜在恶性GISTs。55例GISTs中，良性12例，潜在恶性20例，恶性23例；发生于胃25例，肠20例，其它部位(包括食道、盆腔、肠系膜)10例；男24例，女31例；年龄34～78（S=54）岁；梭形细胞型39例，上皮细胞型7例，混合细胞型9例；肿瘤小于5cm22例，肿瘤大于5cm 33例；肿瘤为单发结节52例，肿瘤为多发结节3例；原发肿瘤45例，复发肿瘤10例。
1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学检测 55例胃肠道间质瘤标本均经100ml/L福尔马林固定，常规石蜡包埋，4μm连续切片，经过脱蜡水化，采用SABC法进行免疫组织化学染色。具体操作步骤简述如下：石蜡切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，置于30ml/L的H2O2中5min，消除组织内源性过氧化物酶，EDTA修复液中微波修复10min，冷却后PBS洗3次。滴加正常山羊血清，室温孵育30min，以封闭特异性抗原。甩去多余的液体后，滴加一抗，稀释度为1：100～1：50，37℃孵育1h。PBS洗3次，滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30min。PBS洗3次，加入LSAB复合物，37℃孵育30min。PBS洗3次，DAB显色，苏木素复染。IGF1和IGF2单克隆抗体购自博士德生物工程有限公司。实验中以PBS代替一抗作为阴性对照，已知的阳性组织（子宫内膜）作为阳性对照。
1.2.2 结果判定 IGF1和IGF2以细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性细胞，阳性细胞数超过肿瘤细胞总数的10%计为阳性，少于10%计为阴性。
1.3 统计学分析 采用SPSS8.0软件进行统计学分析，根据不同要求分别进行了Mann-Whitney检验、Kruskal-Wallis检验和Spearman等级相关分析，P<0.05时有统计学意义。
2 结果
2.1 IGF1在GISTs中的表达 55例GISTs中，34例(61.8%)IGF1阳性表达，阳性颗粒位于细胞浆。通过Mann-Whitney检验和Kruskal-Wallis检验，IGF1的表达率与GISTs肿瘤直径及组织学分级有关（表1），肿瘤直径大于5cm组IGF1的阳性表达率为75.8%,明显高于小于5cm组的40.1%(P=0.01)。潜在恶性组和恶性组的IGF1阳性表达率分别为60.0%及82.6%明显高于良性组的25.0%(P=0.004)。两两比较显示，良性组和恶性组之间IGF1的阳性表达率有显著性差异(P=0.001)，但良性组和潜在恶性组之间、潜在恶性组和恶性组之间IGF1的表达率均无显著性差异（P>0.05）。不同性别、组织学分型、部位、肿瘤结节数、原发/复发之间IGF1的表达率也无显著性差异（P>0.05）。
2.2 IGF2在GISTs中的表达 55例GISTs中，27例(49.1%)IGF1阳性表达，阳性颗粒位于细胞浆。通过Mann-Whitney检验和Kruskal-Wallis检验，IGF2的表达率与GISTs肿瘤直径及组织学分级有关（表1），肿瘤直径大于5cm组IGF2的阳性表达率（66.7%）明显高于小于5cm组的阳性表达率（22.7%，P=0.002)。潜在恶性组和恶性组的IGF2阳性表达率分别为50.0%及73.9%，明显高于良性组的0表达(P=0.004)。两两比较显示，良性组和恶性组之间IGF2的阳性表达率有显著性差异(P=0.000)，良性组和潜在恶性组之间IGF2的阳性表达率有显著性差异(P=0.004)，但潜在恶性组和恶性组之间IGF2的表达率无显著性差异（P>0.05）。不同性别、组织学分型、部位、肿瘤结节数、原发/复发之间IGF2的表达率也无显著性差异（P>0.05）。
3 讨论
GISTs的概念是Mazur［4］等于1983年根据肿瘤的分化特征提出来的。CD34是最早用于该肿瘤诊断的标记物，1998年Nakahara［5］等首次发现GISTs中存在原癌基因CD117的突变和高表达，此后的大量研究也证实了这一观点。联合应用CD117和CD34的免疫组化分析已成为目前诊断GISTs最为可靠的方法［2］，但对于GISTs良恶性的判断和预后的指标一直是近年来研究的热点。现已明确，肿瘤的发生不仅是细胞异常增殖的结果，还与细胞凋亡有密切的关系。本实验通过检测细胞凋亡调控基因IGF和IGFR在GISTs中的表达，探讨其在GISTs发生、发展及恶性转化中的作用和关系。
表1 IGF1和IGF2在GISTs中的表达与临床病理学特征的关系（略）
Table 1 Expression of IGFs and IGFRs in GISTs and clinicopathologic significance
3.1 胰岛素样生长因子系统的作用及组成 胰岛素样生长因子系统在正常生理活动中起着极为重要的作用，与胚胎分化、个体发育密切相关，参与糖、脂肪和蛋白质代谢，该系统异常是糖尿病、内分泌紊乱、癌症等多种疾病的病因之一。IGF系统包括3个配体, 即胰岛素、胰岛素样生长因子Ⅰ( IGF-Ⅰ)、IGF-Ⅱ和3个受体,即胰岛素受体(The insulin receptor, IR)、胰岛素样生长因子Ⅰ受体(IGF-Ⅰ receptor, IGF-ⅠR)和甘露糖-6-磷酸IGF-Ⅱ受体(The mannose-6-phosphate IGF-Ⅱreceptor, M-6-P / IGF-ⅡR) 以及6 个IGF 结合蛋白(IGF2 binding proteins, IGFBP)［6］。
IGF的生物学功能是通过与特异性的靶细胞表面受体结合而实现的。IGF在体内通过循环或局部效应来影响细胞的生长和分化，是介导生长激素促进动物生长的因子。IGF是有丝分裂原，是细胞从G1期向S期转变所必需的因子，它通过自分泌和旁分泌机制对许多组织细胞的增殖、分化起调节作用［7］。
胰岛素样生长因子I又称为生长介素，可在机体大多数组织中表达。IGF-Ⅰ的主要作用之一是促进细胞的生存。已知的几种IGF-Ⅰ介导的促细胞生存分子机制包括PBK/AKT，MAP激酶和14-3-3 蛋白等分子。这些蛋白都与促凋亡蛋白(Proapop totic protein)前体的磷酸化增加有关。在神经细胞中，IGF-Ⅰ通过P BK/AKt依赖的信号转导途径，诱导叉头转录因子的磷酸化，抑制细胞凋亡。IGF-Ⅰ通过P38应激激活蛋白激酶(Stress-activated p rotein kinase, SAPK)和PBK/AKT途径促进cAMP 反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB )转录因子的磷酸化，从而促进抗凋亡因子bcl-2基因的转录。IGF-Ⅰ通过PBK介导的抗凋亡作用，同样在抑制甘露醇诱导细胞凋亡过程中起重要作用。甘露醇诱导FAK脱磷酸化和降解在capsase活化中作用很明显, IGF-Ⅰ能够抵消这种作用，促进细胞黏附和存活［8］。
IGF1和IGF2主要通过IGF1R，构成自分泌或旁分泌环路而发挥作用。IGF1R属于受体酪氨酸激酶（RTK），是由α、β亚基组成的四聚体，β亚基胞内区存在酪氨酸激酶结构域及酪氨酸磷酸化位点。配体与受体的结合引起受体分子的两个α、β亚基之间的别构作用，激活了受体的酪氨酸激酶活性，引起胞内区多个酪氨酸的自我磷酸化，经过一系列信号转导，激活细胞内mRNA转录并调节蛋白质的合成，从而发挥促进细胞增殖的作用［9］。
3.2 GISTs中IGFs的表达及作用机制探讨 IGFs是调节细胞增殖、分化和转化的关键因素，在肿瘤，尤其是乳腺癌、前列腺癌和结肠癌的发生中起着重要的作用。肿瘤细胞不断进行有丝分裂的能力和抗凋亡作用主要依赖与细胞表面IGFs因子的结合能力［10］。已有的研究证明IGF1具有抗凋亡的作用［11］。本实验中，55例GISTs中IGF1的阳性率为61.8%，IGF2的阳性率为49.1%，提示GISTs中有IGFs参与作用。良性组、低度恶性组和恶性组之间IGF1和IGF2的阳性率存在显著性差异，IGF1和 IGF2在潜在恶性组和恶性组GISTs中表达率较高，而在良性组中表达较低, 但潜在恶性组和恶性组之间无统计学意义，提示在GISTs由良性向恶性转变的过程中，在细胞恶性增生更加活跃的同时，细胞自发凋亡可能也增加。因此，可以认为IGF表达高提示增加了恶性潜能。本实验发现肿瘤直径大于5cm组和小于5cm组之间IGF1 和IGF2的阳性率存在显著性差异，提示IGFs基因阳性表达的GISTs可能具有更高的细胞增殖能力，即IGFs可能在GISTs的发生和增殖中发挥作用。我们推测IGF的作用机制可能是通过与IGFR构成自分泌或旁分泌环路而发挥作用，抑制卡哈尔间质细胞样的前体细胞凋亡，使细胞数不断增多，增加基因突变的机会，从而促使GISTs肿瘤的发生，使肿瘤直径增加，核分裂增多，临床上表现为恶性度增加。但本实验发现有些常用的恶性指标如肿瘤结节数的多少以及原发/复发之间IGF1和IGF2的表达率没有显著性差异，推测可能与标本例数少有关，下一步将搜集更多标本进一步完善实验。
3.3 进一步研究设想 IGF1R介导IGF1和IGF2的生物学作用，IGF1R在大多数转化细胞中均有表达，具有抗调亡和促进细胞生长的作用［12］，一旦IGF1R缺乏，肿瘤细胞将发生凋亡［13］。因此利用IGF1R的反义策略，可区别正常细胞和肿瘤细胞，对恶性肿瘤的治疗有重要的临床价值［14］。
在GISTs由良性向恶性转变的过程中，IGF1、IGF2可能通过与IGFR之间的交互调节发挥作用。进一步研究IGFR在GISTs中的表达及利用其的反义策略作为肿瘤的辅助治疗将会是今后很有前景的研究方向。
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作者单位：中山大学附属第二医院，广东 广州 510120